應用二硫蘇糖醇消除達雷木單抗對輸血相容性檢測干擾的探討

強新晨，楊華瑩，邵俊良

(南京醫科大學附屬無錫人民醫院，江蘇 無錫214023)

多發性骨髓瘤(MM)是一種起源于骨髓的漿細胞惡性克隆增殖性疾病，好發于中老年人[1],發病率逐年增加，是血液系統較為常見惡性腫瘤。大多數患者隨著近些年來免疫調節劑和蛋白酶體抑制劑的臨床應用后總體生存率有顯著提高，患者生存質量得以改善，然而難治性和復發性骨髓瘤患者的治療效果不盡如人意。人CD38抗原為單鏈Ⅱ型跨膜糖蛋白，長度為45kDa，調節細胞活化、分化和增殖[2],通常在造血干細胞、T細胞、NK細胞和樹突細胞中表達，外周血中性粒細胞和B淋巴細胞不表達，骨髓瘤細胞高量表達，成為MM免疫靶向治療藥物作用的新靶點[3]。達雷木單抗(DARA)是一種針對CD38的人源免疫球蛋白(Ig)G1κ單克隆抗體，2015年成為首個獲得批準用于高危性或復發性骨髓瘤患者治療的抗-CD38單克隆抗體，具有較好的臨床療效和安全性[4-5]，中國多發性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)中增加了DARA入選治療方案[6-7]，聯合免疫調節劑和蛋白酶體抑制劑可進一步提高療效[8]，臨床使用病例數量日趨增加。

由于紅細胞也表達CD38抗原分子，當患者應用DARA藥物治療時，與紅細胞表面低水平表達的CD38結合，引起不規則抗體篩檢、特異性抗體鑒定等輸血相容性檢測出現假陽性[9]，從而掩蓋有價值的同種免疫性抗體。隨著接受抗-CD38治療患者例數的增多，如何消除該抗體對輸血相容性檢測的干擾，保障患者輸血安全，成為亟待解決的難題，本文通過應用二硫蘇糖醇(DTT)，結合文獻[10-11]選用低濃度DTT方法處理紅細胞，結合微柱凝膠法進行相關實驗，消除其對輸血相關血清學試驗干擾，確保DARA治療患者臨床用血安全。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例：女性患者，59歲，確診多發性骨髓瘤18月，2020年3月起采用硼替佐米聯合地塞米松/環磷酰胺化療5次及對癥支持治療，10月起DARA 700 mg聯合地塞米松及來那度胺進行治療，患者入院時不規則抗體篩選為陰性，因患者貧血擬輸血支持治療，輸血前檢測發現不規則抗體篩選及特異性抗體鑒定試驗均出現泛凝集反應，顯示抗體無特異性，與供血者交叉配血主側有凝集。

1.2 試劑與儀器

試劑包括AB/D血型微柱檢測卡(長春博迅生物技術公司)；微柱凝膠檢測卡(IgG+C3d,美國BIO-RAD)；ABO反定型細胞(上海血液生物醫藥公司)；抗體篩選細胞(江陰立博醫藥生物技術公司)；pH7.2PBS緩沖液(飛凈生物科技公司)；pH8.0PBS緩沖液(飛凈生物科技公司)；1,4-二硫代-DL-蘇糖醇(DTT，美國Sigma)；相容性檢測質控品(長春博迅生物技術公司)；抗K試劑(江陰立博醫藥生物技術公司)。儀器包括37℃卡式孵育器；卡式離心機。

1.3 0.02 mol/L DTT溶液的配置

稱取DTT1.0 g溶解于32 ml pH=8.0PBS緩沖液中，充分攪拌溶解后分裝于PE管中，-20℃保存備用，使用時先復溶,后用pH7.2PBS緩沖液1∶9稀釋。

1.4 輸血相容性檢測

患者AB/D血型、直接抗人球蛋白試驗按照說明書要求操作，抗體篩選試驗、抗體鑒定和交叉配血試驗采用微柱凝膠卡法進行，將抗體篩選細胞、抗體鑒定譜細胞和獻血員紅細胞用生理鹽水洗滌3次后制成0.8%紅細胞懸液，操作步驟：在微柱凝膠卡上部反應腔內加入上述0.8%紅細胞懸液50 μl和0.02 mol/L DTT溶液25 μl，用移液器仔細混勻5次，將凝膠卡在37℃孵育15 min，再加入25 μl患者血漿，用移液器仔細混勻5次，37℃孵育15 min，然后放入卡式離心機離心，觀察有無凝集現象，有凝集試驗為陽性。

1.5 對照試驗

本研究中采用0.02 mol/L DTT處理紅細胞抗原方法設立對照試驗，選擇表達M、Jka、E、K抗原的O型紅細胞作為對照細胞，DTT處理前均確認M、Jka、E、K抗原為陽性，選用經血型參比實驗室確認抗M(IgM)、抗Jka、抗E的血漿以及抗K試劑血清分別與DTT處理前/后的M、Jka、E、K抗原紅細胞作為效果評估試驗，操作步驟與前述相同。

2 結果

2.1 患者血型、直接抗人球蛋白試驗

患者血型為O型，CcDEe,自身對照陰性，直接抗人球蛋白試驗陰性；治療后，對ABO、Rh血型分型檢測無影響，自身對照陰性，直接抗人球蛋白試驗陰性。

2.2 不規則抗體篩選、抗體特異性鑒定和交叉配血

DARA治療后21天后，未經DTT處理，紅細胞不規則抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細胞全凝集，凝集強度1+—2+，見圖1-(1)。經DTT處理后，紅細胞不規則抗體篩選Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細胞均為陰性，見圖1-(2)。紅細胞抗體特異性鑒定試驗，結果顯示均凝集，凝集強度為1+—2+，顯示抗體無特異性，見圖1-(3)。選取2份與患者同型血液交叉配血試驗主側為不合，凝集強度為3+，經DTT處理后交叉配血主側相合，見圖2。

圖1 患者抗體篩選、抗體特異性鑒定試驗結果

2.3 對照試驗

抗M、抗Jka、抗E血漿和抗K血清與未經DTT處理的M、Jka、E、K抗原紅細胞微柱凝膠卡反應均為陽性；與經DTT處理后M、Jka、E、K抗原細胞反應均為陽性，結果顯示經處理后不影響M、Jka、E、K抗原與對應抗體的反應性，見圖3。

3 討論

由于CD38抗原在MM患者淋巴細胞上廣泛高表達，CD38單克隆抗體-DARA能靶向結合腫瘤細胞上高表達CD38分子，通過介導補體/抗體依賴的細胞毒作用、誘導細胞凋亡作用等多種機制殺傷靶細胞、消除表達CD38抗原的調節性淋巴細胞和來源于髓細胞的抑制細胞達到免疫調節作用以及抑制CD38酶活性，誘導腫瘤細胞死亡，發揮抗腫瘤免疫效應[12]，已經成為MM的免疫治療新手段，含DARA的聯合化療方案已經成為臨床挽救性治療措施[13]，能改善患者預后、延長患者總生存期。

圖2 供血者 DTT處理前、后交叉配血結果

圖3 M、Jka、E、K抗原紅細胞DDT處理前、后抗體檢出結果

由于人類紅細胞表面也有少量CD38抗原表達，DARA可以和患者、供血者、抗體篩選試劑紅細胞表面結合，導致患者直接抗人球蛋白試驗假陽性，干擾不規則抗體篩選，抗體特異性鑒定反應呈全陽性反應，與供血者交叉配血主側呈陽性反應，造成輸血相容性檢測困難，影響輸血治療[14-15]。通常情況下，抗-CD38抗體與患者紅細胞結合后會導致直抗實驗陽性，但是該種結合不會影響血型鑒定，本研究中患者紅細胞直抗試驗應用DARA前、后均為陰性結果，研究表明[16]是由于隨著藥物使用后(一般7天以后)抗體對紅細胞表面CD38抗原清除效應逐漸顯現，直抗陽性減弱甚至為陰性結果。這種對輸血相容性檢測的干擾可在末次使用后持續2-6個月[17]，有可能掩蓋患者血漿中存在的其他同種免疫抗體，引發溶血性輸血反應，給患者造成輸血風險。有學者建議在患者應用DARA前預留患者血樣用于治療后續輸血相容性檢測，但是該策略由于血樣保存時效有限和不能真實反應患者當前免疫狀態，易造成新產生的同種抗體漏檢。

DTT屬于一種還原劑，可以還原破壞抗原蛋白質中半胱氨酸之間用于維持二級結構的二硫鍵，紅細胞表面CD38抗原被破壞后，DARA抗體無法與之相結合，消除該抗體對輸血相容性檢測的干擾。經典法DTT預處理供血者紅細胞方法耗時長、步驟繁瑣，洗滌過程中紅細胞易溶血，造成細胞表面部分抗原破壞[18]，采用本研究方法處理紅細胞表面CD38抗原，結合微柱凝膠卡的方法，比常規微柱凝膠卡法交叉配血耗時僅增加15 min，省略紅細胞DTT處理過程中多次洗滌，實驗時間顯著縮短。紅細胞DTT處理前患者血漿與抗體篩選細胞、抗體特異性鑒定譜細胞表現為全陽反應，凝集強度為1+—2+，反應無特異性，與供血者交叉配血試驗主側不相合，凝集強度為3+，泛反應性有可能掩蓋同種免疫性抗體的反應，存在漏檢的風險。用低濃度0.02 mol/L DTT處理上述抗體篩選細胞、特異性鑒定譜細胞后，與患者血漿均為陰性反應，提示患者血漿中僅存在抗-CD38抗體，未檢出其他同種免疫性抗體，與獻血員交叉配血實驗主側均為相合。實驗結果顯示經過DTT處理后，有效消除DARA對輸血相容性檢測的干擾，確保接受該種藥物治療患者輸血及時性、安全性。

依據我國血型意外抗體的分布情況[19-20]，紅細胞血型意外抗體檢出以Rh、MNS、KIDD和LEWIS系統最為常見，為驗證改變DTT濃度處理抗原效果和對常見同種免疫性抗體檢測能力，尤其是對IgM類抗體的影響，選擇表達M、Jka、E、K抗原O型紅細胞在DTT處理前、后分別與特異性人源抗M(IgM)、抗Jka、抗E和單克隆抗K進行間接抗人球蛋白實驗，結果顯示DTT處理后M、Jka、E、K抗原均能檢出，提示本方法可以保留K抗原，與Hosokaw等[21]結果相同，M抗原反應陽性表明對IgM抗體影響較弱，DTT與抗體血清反應時間較經典方法短存在一定關系[22]。我國為多民族國家，Kell血型抗原分布存在種族差異，維吾爾族、回族和漢族K抗原陽性率分別為3.16%、1.36%、0.17%[23]，在少數民族地區抗K抗體產生幾率比漢族地區高，經典法DTT處理紅細胞技術存在破壞CD38以外紅細胞抗原(如Kell、YT、JMH等抗原)，導致相關血型抗體漏檢的局限性。通過改變DTT濃度處理紅細胞，可以在保留紅細胞表面K抗原的情況下消除DARA對輸血相容性檢測的干擾，確保K抗原陰性患者輸血安全,由于樣本數量較少，可行性有待進一步驗證。