負載血管內皮生長因子的鄰苯二酚殼聚糖體外藥物緩釋性能及抗菌性研究

韓佳岐，田 瑗，姜 秋*,袁文錦，楊 婕，董 寧

(1.吉林大學口腔醫院 兒童口腔科，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 健康管理中心，吉林 長春130033)

年輕恒牙常因齲病、牙外傷或發育異常等導致牙髓感染壞死，牙根發育停止。牙髓組織工程再生是一種有潛力的多學科治療方法，對于應用于牙髓組織工程再生中的支架材料，在生物相容性、藥物負載性能、機械性能以及降解性等方面均有要求[1]，此外，還應考慮血運重建、細胞-基質相互作用、再礦化和抗菌性[2]等。殼聚糖是一種具有良好生物相容性，生物降解性和廣譜抗菌性[3]的天然多糖，但在中性pH溶劑中溶解度低使其應用范圍受限[4]。有研究用鄰苯二酚對殼聚糖進行改性[5-6]，使殼聚糖在中性pH溶液中溶解性顯著提高，生物相容性和親水性得到優化，避免了負載重組蛋白等生物大分子藥物時支架的低pH使藥物變性。另外，鄰苯二酚殼聚糖在組織表面有很強的黏附性[7-8]，不僅植入根管后可以附著在根管壁上，提供較穩定的結構支撐，還能促進細胞黏附。

血運重建是牙髓組織再生的關鍵營養基礎，大量研究表明血管內皮生長因子(VEGF)在再生醫學中起促血管生成的作用。然而VEGF在體內半衰期短，加入支架中則可以避免其在體內快速降解，提升療效[9-10]。本課題組前期體外細胞實驗驗證，改性后水凝膠具有更好的促進細胞黏附性能[11]。本實驗對鄰苯二酚殼聚糖水凝膠與生物應用相關的物理性能進行表征，并研究其對VEGF的控釋性能以及抗菌性，以構建理想的牙髓再生支架材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器殼聚糖(分子量50-190 kDa)、京尼平、3-(3,4-二羥基苯基)丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(Sigma Aldrish 公司，美國)； VEGF(Proteintech公司，美國)；滲析袋(3500W)(Biosharp公司，中國)；酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實業有限公司，中國)；哥倫比亞血瓊脂培養基(溫州康泰生物科技有限公司，中國)；腦心浸液肉湯培養基、維生素K1(青島海博生物技術有限公司，中國)；瓊脂粉、氯化血紅素(上海生工生物科技有限公司，中國)；傅里葉紅外光譜儀(Bruker公司，美國)；酶標儀(Bio-TEK公司，中國)；恒溫細胞培養箱(SANYO公司，日本)；無菌超凈臺(安泰技術有限公司，中國)；旋轉流變儀(Discovery HR-2，TA Instrument，美國)；接觸角測定儀(DataPhysics Instruments，美國)。

1.2 EDC偶聯法制備鄰苯二酚殼聚糖配制60 ml 1%(w/v)殼聚糖溶液，調節溶液pH值至5.0。稱取 0.145 g 3-(3,4-二羥基苯基)丙酸溶于15 ml乙醇中，0.356 g EDC溶于15 ml去離子水，將兩種溶液混合，在攪拌下快速加入到殼聚糖溶液中，隨后調節pH值至4.8，避光繼續攪拌18 h后，將反應溶液置于滲析袋(3 500 w)內，在pH=5的酸化去離子水中滲析3天[12]，冷凍干燥24 h，得到鄰苯二酚殼聚糖凍干樣品，化學合成反應式見圖1。

圖1 鄰苯二酚殼聚糖合成反應式

1.3 載有VEGF的水凝膠的制備將適量的VEGF蛋白溶液加入鄰苯二酚殼聚糖溶液中(最終VEGF濃度為100 ng/ml)，混勻后，滴加2%京尼平的乙醇溶液(殼聚糖與京尼平的質量比為 10∶1)，攪拌30 min，放于恒溫恒濕箱中交聯1 d，得到鄰苯二酚殼聚糖VEGF復合水凝膠。

1.4 性能表征

1.4.1紅外光譜檢測 使用傅里葉紅外光譜儀對殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖進行分析，確定鄰苯二酚成功接枝到殼聚糖上。

1.4.2流變性分析 使用旋轉流變儀對水凝膠的力學性能逆行表征。室溫下，采用震蕩應變為1%，振蕩頻率為1 Hz的振幅掃描檢測殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的儲能模量(G’)和損耗模量(G”)隨時間的變化情況。

1.4.3接觸角測試 通過接觸角測定儀檢測充分溶脹前后殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的水接觸角，分析其親水性。在室溫下使用懸滴法滴加2 μl去離子水于水凝膠表面，捕獲水凝膠表面上水滴的圖像，并對獲得的圖像進行計算與分析。為了減少實驗誤差，在每個樣品表面的三個不同點重復測量，求得接觸角的平均值。將殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖的平均接觸角值進行比較。

1.5 藥物體外緩釋試驗一定量的載藥水凝膠浸于PBS中，設置三個平行實驗組，分別于0.5天，1.5天，2.5天，3.5天，4.5天，5.5天，6.5天，7.5天，9.5天，11.5天，13.5天，15.5天，18.5天和21.5天的特定時間點，取1 ml上清液保存，并將剩余液體全部吸出，重新注入等體積PBS。ELISA法繪制VEGF標準曲線，測定樣品中VEGF濃度，計算釋放率，繪制緩釋曲線。

1.6 抗菌性能測試大腸桿菌(ATCC25539，購于湖南豐暉生物科技有限公司)和具核梭桿菌(ATCC25586，購于上海保藏生物技術中心)用作試驗菌，以評估水凝膠的體外抗菌活性。

1.6.1抑菌環法 在固體培養皿上涂布100 μl細菌懸浮液(1×108cfu/ml)，將水凝膠置于培養皿上，37℃溫育24小時。通過觀察水凝膠表面及周圍有無細菌區來定性測定水凝膠對細菌的抑制作用。

1.6.2菌落計數法 將200 μl水凝膠與1 ml細菌懸浮液(106cfu/ml)混合放入5 ml EP管中，不加樣品作為空白對照組。將EP管在37℃培養箱中孵育22-24 h后，對菌液進行連續稀釋至1萬—10萬倍，取100 μl稀釋后菌液涂布于固體培養基，孵育24 h，通過計算菌落數定量測定水凝膠的抑菌率(BR)。

抑菌率計算公式：BR=(B-A)/B×100%，式中：A為實驗組菌落數；B為對照組菌落數。

1.7 統計學分析采用PASW 18.0軟件進行統計學分析，菌落計數結果滿足正態分布與方差齊性，實驗組與對照組間比較采用兩獨立樣本t檢驗分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅外光譜分析圖2為殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖的紅外光譜圖。從殼聚糖紅外光譜圖中可以看到1 154 cm-1處和1 184 cm-1處為殼聚糖中典型的C-O的伸縮振動吸收峰，1 658 cm-1和1 613 cm-1分別對應酰胺Ⅰ基和酰胺Ⅱ基的振動吸收峰。與殼聚糖相比，鄰苯二酚殼聚糖的譜圖在波長1 500 cm-1-1 700 cm-1處出現明顯差異：在1 523 cm-1處出現了新的吸收峰，為芳香族C=C骨架的振動吸收峰[12]，證明鄰苯二酚成功接枝到殼聚糖分子上。

2.2 流變性分析圖3為殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖水凝膠流變性能圖，在頻率為1 Hz的振蕩下，隨著時間的延長，殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖的水凝膠材料的儲能模量(G’)始終大于損耗模量(G”)，證明材料始終處于凝膠狀態。并且鄰苯二酚改性后殼聚糖的G’顯著提高，從3 000 Pa增加到13 000 Pa，G”也具有類似的變化趨勢。表明鄰苯二酚殼聚糖比殼聚糖具有更好的彈性性能，結構更穩定。

2.3 親水性檢測去離子水液滴和水凝膠表面之間測得的接觸角能反映材料表面潤濕性。接觸角值越小，表明材料表面的潤濕性越高，親水性也越強。如圖4所示，接觸角測試中，當水滴與充分溶脹前的鄰苯二酚殼聚糖水凝膠表面接觸時，水滴瞬間鋪展，被水凝膠吸收；而溶脹前殼聚糖的水接觸角為24.0°±0.5°，具有一定的親水性，但其性能低于改性后殼聚糖。充分溶脹3天后，鄰苯二酚殼聚糖和殼聚糖的水接觸角分別為15.9°±2.7°和67.2°±2.9°，雖均有升高，但鄰苯二酚殼聚糖的水接觸角仍明顯低于殼聚糖。以上結果表明鄰苯二酚改性后殼聚糖的親水性得到顯著提高。

圖2 殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖紅外光譜圖(CS：殼聚糖；Cat-CS：鄰苯二酚殼聚糖。Cat-CS的譜圖在波長1 523 cm-1處出現芳香族C=C骨架的振動吸收峰，證明鄰苯二酚成功接枝到殼聚糖分子上。)

圖3 殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖水凝膠流變變化情況(Cat-CS的G’和G”均比CS顯著提高，G’從3 000 Pa增加到13 000 Pa。)

2.4 體外緩釋行為用ELISA法檢測梯度稀釋的VEGF標準品(濃度分別為800 pg/ml、400 pg/ml、200 pg/ml、100 pg/ml、50 pg/ml、0 pg/ml)在波長為450 nm處的吸光度，繪制VEGF標準曲線(圖5A)，標準曲線的直線回歸方程式為y=0.066 81 + 0.001 87x，樣品線性回歸于預期濃度相關系數R值為0.992 7。

通過ELISA試劑盒檢測在21天中的特定時間點吸取的上清液的實際濃度。得到鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的藥物累積釋放量和累積釋放率。從藥物累積釋放曲線(圖5B)可以看出，前15天的每日藥物釋放量基本穩定，其中，5.5天至15.5天較前5天輕微放緩；最后一周曲線趨勢逐漸趨近平緩，藥物釋放速率逐漸減慢，但并未停止釋放。21天時藥物累積釋放率達到52.95 %。以上結果表明鄰苯二酚殼聚糖水凝膠對藥物有良好的控釋作用，并且可以達到較長時間的穩定釋放。

圖4 溶脹前后的殼聚糖水凝膠與鄰苯二酚殼聚糖水凝膠接觸角變化情況(溶脹前后Cat-CS的水接觸角均小于CS，Cat-CS親水性優于CS。)

圖5 鄰苯二酚殼聚糖水凝膠藥物緩釋性能 (A:VEGF標準曲線;B:藥物累積釋放曲線;21天內載有VEGF的鄰苯二酚殼聚糖持續釋放VEGF。)

2.5 體外抗菌性能微生物感染會阻礙牙髓再生過程，因此水凝膠具有抗菌能力十分重要。使用傷口感染的常見菌E.coli和根管感染中常見的革蘭氏陰性厭氧菌F.n評估水凝膠的抗菌能力。如圖6A所示，鄰苯二酚殼聚糖水凝膠表面及周圍一定范圍內未見E.coli或F.n生存。水凝膠對E.coli和F.n的抑制區直徑分別為約13.5 mm和14.8 mm。

通過抑菌率的計算可以定量體現出水凝膠的抗菌性的強弱。水凝膠對E.coli和F.n處理24小時后菌落形成單位較空白對照組相比均有明顯減少，差異具有統計學意義(E.coli組：t=82.814，P<0.05；F.n組：t=16.704，P<0.05)。E.coli的24小時抑菌率為93.8%，對F.n的抑菌率為86.7%，說明殼聚糖改性產物具有比較優異的抗菌性。

圖6 鄰苯二酚殼聚糖水凝膠抗菌性能(A：抑菌環法檢測鄰苯二酚殼聚糖水凝膠對E.coli與F.n的抗菌性,水凝膠在兩種細菌的固體培養基上均可形成明顯的抑菌環；B：菌落計數法檢測鄰苯二酚殼聚糖水凝膠對E.coli與F.n抗菌性,兩種細菌菌液分別培養24 h后，加入水凝膠組的菌落計數明顯少于空白對照組。)

3 討論

牙髓組織工程再生中的支架材料有許多性能要求，比如在機械性能方面，支架材料的彈性模量會對間充質干細胞的分化產生影響，如血管等軟組織再生需要支架材料的彈性模量約為2-15 kPa[13]。殼聚糖及其衍生物作為天然生物材料滿足組織支架的基本要求和特性。由于存在氨基和兩個羥基官能團，殼聚糖可以進行許多反應，例如醚化，酯化，交聯等，以此進行化學和機械修飾，通過結構修飾賦予所需的特性和功能[14]。因此，盡管殼聚糖僅能在酸性條件下溶解使其應用受限，但可以通過引入水溶性材料的親水部分等方法提高溶解度[15-16]。本研究中，通過EDC偶聯反應引入鄰苯二酚基團對殼聚糖進行改性，紅外光譜檢測顯示鄰苯二酚基團成功接枝到殼聚糖長鏈上，改性后殼聚糖可以在中性條件下溶解，在溶液中加入京尼平交聯劑后形成鄰苯二酚殼聚糖水凝膠，流變性分析結果顯示在頻率為1Hz的振蕩下，水凝膠的G’和G”基本未發生變化，表明已形成了結構性質較穩定的網絡結構，此外流變數據也顯示出鄰苯二酚殼聚糖的彈性性能比純殼聚糖水凝膠更好。

在牙髓組織工程學中，直接將干細胞注射到根管內的再生能力很差，還需要活性細胞因子促進細胞定居及其基質沉積，因此，將活性生物分子載入具有控釋性能的支架內對于它們在受損組織內的遞送以及對細胞的作用至關重要。VEGF可以通過其受體介導的信號通路調控血管內皮細胞增殖、遷移，改變血管通透性，這些功能在血管生成的初期發揮重要作用，另外VEGF還具有干細胞募集的功能。但VEGF在體內的半衰期很短，向缺血部位局部注射或系統注射重組VEGF蛋白溶液的臨床效果并不理想[6]，因此，人們一直在探究親水性藥物在水凝膠支架中的緩釋效果和應用。本研究中，溶脹前后的鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的水接觸角為0°和15.9°±2.7°，均較殼聚糖水凝膠明顯減小，說明鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有更高親水性、含水性和更優的生物相容性。鄰苯二酚對殼聚糖的修飾在載藥和緩釋方面的影響主要為：(1)改善殼聚糖的水溶性，避免酸性條件下VEGF變性，材料的生物相容性也有所提升；(2)對殼聚糖水凝膠親水性的改善，進而增加水溶性VEGF的負載，并提高材料通透性。因此，鄰苯二酚殼聚糖水凝膠在親水性藥物的控釋載體應用方面更具優勢。之前的研究表明[6]，應用于口腔黏膜給藥的鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有持續遞送藥物的能力。本實驗在鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的合成過程中將VEGF混合其中，水凝膠網絡的交聯和藥物負載同時進行，VEGF以溶液的形式均勻分散在水凝膠基質中并吸附于支架上，作用力為物理吸附的范德華力。本實驗采用ELISA對37℃、中性pH環境下水凝膠對VEGF的累積控釋進行了檢測，載藥水凝膠持續緩慢穩定地釋放藥物，未見突釋現象，21天時累積釋放率達52.95%，表明鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有藥物緩釋能力。在親水性藥物均勻分布于水凝膠基質中的控釋系統中，最常見藥物釋放機制是擴散，藥物到達水凝膠表面附近即可釋放出來，而水凝膠內部的藥物擴散到表面需要一定時間，因此VEGF釋放速率在實驗后期逐漸減低。有研究將殼聚糖/β-甘油磷酸酯(CS/β-GP)水凝膠作為VEGF緩釋體系，使用ELISA檢測VEGF的8日釋放曲線。結果顯示前4天VEGF的每日釋放量逐漸增加。從第4天開始呈下降趨勢，8天后累積釋放量趨于峰值，共有12%的VEGF蛋白從水凝膠中釋放出來[17]。本實驗中前15天內藥物釋放量均較穩定，21日累積釋藥量略低，可能由于材料適中的機械強度提高了藥物在水凝膠網絡中的捕獲能力[18]，并且有部分VEGF可能與鄰苯二酚殼聚糖發生了交聯，結合在水凝膠網絡中，僅通過擴散作用無法釋放。

大多數牙髓和根尖周疾病是由于口腔細菌的直接或間接參與而誘發的。一項系統回顧顯示，79%牙髓再生失敗的臨床病例是由于持續感染[19]，這表明控制根管中的細菌是再生治療中關鍵的步驟。牙髓血運重建治療中，消毒主要依靠沖洗和根管內封藥的化學消毒，只有極少或沒有機械預備，會導致根管內細菌殘留。這些殘留的細菌可以抑制干細胞分化，影響組織形成和再生過程的成功。因此，在不影響細胞功能的情況下，提高支架材料的抗菌效果，會提高再生牙髓治療過程的成功率。

根管感染中常見革蘭氏陰性厭氧菌，其細胞壁富含脂多糖，與革蘭氏陽性菌細胞表面結構不同，這導致不同菌種對殼聚糖具有不同的敏感性。有研究表明，革蘭氏陰性菌對殼聚糖的敏感性可能高于革蘭氏陽性菌[20]。本研究使用兩種革蘭氏陰性菌即E.coli和F.n測試鄰苯二酚改性后殼聚糖水凝膠的抗菌性能，實驗結果顯示鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有良好的抗菌性，對兩種細菌均可形成一定范圍的抑制區域，并對浮游細菌的抗菌率分別達到93.8%和86.7%，抗菌率未達95%以上可能因為引入鄰苯二酚基團消耗了殼聚糖中的部分氨基，減弱了正電荷效應，使抗菌性能稍有減弱[12]。以往純殼聚糖及其衍生物的抗菌應用大多是作為抗生素遞送載體，有研究報道殼聚糖-植物化學偶聯物與紅霉素等抗生素協同表現出很強的抗菌活性[21]，但也有研究發現載有抗生素的殼聚糖水凝膠會對牙髓干細胞的礦化活性產生不利影響[22]。

綜上所述，本研究中成功制備出負載VEGF的鄰苯二酚改性殼聚糖水凝膠，是一種具有良好親水性和適宜的彈性模量的支架材料，具有緩釋細胞因子和抗菌的雙重功能，仍需要進一步對其抗菌機制和體內實驗血管再生進行探索。