希臘牛至輻射誘變突變群體的構建和篩選

郭賀峰，何 悅，殷庭超，蔡 冬，劉信寶，張 敬，徐 彬

（1.南京農業大學草業學院, 江蘇 南京 210095；2.福建傲農生物科技集團股份有限公司, 福建 漳州363000；3.福建省生豬營養與飼料重點實驗室，福建 漳州 363000）

牛至(Origanum vulgare)是唇形科牛至屬多年生草本或半灌木植物，也被稱為止痢草、牛膝草、馬郁蘭、小葉薄荷等，是典型的多年生芳香植物。其分布范圍廣泛，原產于歐亞大陸及部分非洲地區，我國大部分省區皆有野生牛至分布[1]。牛至又可被分為6 個亞種，其中希臘牛至(O.vulgaressp.hirtum)香味濃郁、精油含量高、抑菌效果好，被廣為栽培應用[2]。牛至用途多樣，全草皆可入藥，是一味傳統的中草藥，對急性腸胃炎、腹瀉等癥具有很好的療效[3]；牛至香辛味濃郁，能夠改良食物風味，因此在西班牙、墨西哥、希臘等國被當作香料長期使用[4]；牛至花期長、花型優美、花色艷麗，既可用于觀賞，還是一種很好的蜜源植物；此外，牛至花、葉可提取芳香精油，具有較強的抑菌和抗氧化作用[5-7]，因此還被廣泛應用于動物飼料添加劑，能夠保護動物腸道健康，改善肉產品品質，提高生長性能，降低死亡率，減少疾病，提高飼料利用率等[8-15]。近年來，牛至干草和牛至精油的需求量逐年增加，現有野生牛至資源已不能滿足生產需求；另一方面，牛至干草價格較高，限制了其在飼料添加劑中的生產應用。培育高產、優質牛至新品種是解決牛至供需矛盾與應用瓶頸的關鍵環節之一。

輻射誘變是一種快速培育新品種的方法，具有突變頻率高、變異范圍廣、后代性狀穩定快、育種年限短等優點[16]。牛至種子極小，千粒重僅0.1 g，可能對輻射誘變敏感，是誘變育種的理想材料。另外，牛至可以通過扦插或組培等方式擴繁[17]，因此牛至突變體單株能夠通過營養體擴繁保留具有特殊變異性狀。

本研究以南京農業大學草業學院前期篩得到的希臘牛至為材料，利用60Co-γ 射線作為輻射源處理希臘牛至種子，旨在找出適宜牛至種子的輻照劑量，獲得牛至突變體種質資源庫，篩選出具有優異變異表型的突變體，為牛至誘變系品種改良和選育提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

本研究在南京航空航天大學輻照中心進行輻照處理，輻射源為60Co-γ 射線源，裝源量為200 萬Ci。在全自動化玻璃溫室內育苗，溫室內的晝夜溫度28 ℃/23 ℃，實際溫度為設定溫度的 ± 5 ℃，空氣濕度保持在25%～42%。幼苗移栽定植到南京農業大學白馬教學科研基地的試驗田 (119°18′71.96″ E，31°62′0.06″ N)。試驗田土壤質地為黏壤土，容重為1.27 g·cm-3，比重為2.52 g·cm-3，土壤總孔隙度為49.53%，pH 7.45，EC 值為53.21 μS·cm-1，有機質含量為0.82%。

1.2 試驗材料

母本種子材料采自南京農業大學草業學院篩選的希臘牛至株系，母本植株的葉片精油含量4.2%，花的精油含量5.3%，全株(包括莖、葉和花)精油含量3.2%。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照處理

共設置6 個60Co-γ 射線輻照劑量梯度，分別為0、100、200、400、800 和1 600 Gy，劑量率為1.61 Gy·min-1，每個劑量處理置于塑料自封袋中的2 g 種子(約2 萬粒)，以未經輻照的種子作為對照(CK)。

1.3.2 發芽試驗

將輻照后的種子與未處理對照種子均勻擺放在鋪有兩層濾紙的培養皿中，每皿100 粒種子，每個劑量4 個重復，每天定時定量灑水以保持發芽所需濕度，每天記錄發芽數，并根據發芽數計算發芽率、發芽勢和發芽指數。

發芽率 = 發芽數/每皿粒數×100%；

發芽勢 = 5 d 內發芽種子粒數/供試種子數×100%；

式中：Gt為發芽試驗終期內每日發芽數，Dt為發芽日數。

1.3.3 育苗移栽

種子用10 mg·L-1赤霉素溶液處理后[18]，在溫室育苗，育苗基質采用丹麥品式托普泥炭土(pH 5.5～6.0，粒徑 ＜ 6 mm)，將泥炭土打濕后分裝于72 孔穴盤中；依據發芽率計算所用穴盤數與用種量，將種子與細蛭石混合，均勻播于穴盤內，每天噴水保持基質濕潤。種子發芽10 d 后間苗，保持每穴1 株小苗。于2021 年3 月中旬，待幼苗生長至8 cm 高時移栽大田，移栽前試驗田提前挖好排水溝確保排水通暢并噴灑封閉型除草劑隔絕雜草，株行距均設置為30 cm。

1.3.4 突變體表型性狀測定

2021 年7 月 - 8 月，通過對田間突變表型的觀察，篩選出變異明顯的株系，測定對照株系和突變體的表觀性狀，包括株高、葉長、葉寬、莖節長度和分枝數。使用電子游標卡尺測量植株頂端向下第3 節間已舒展葉片最寬和最長處即葉長、葉寬實際值。莖節長度的測定使用電子游標卡尺測量植株頂端向下第3 節節間長度。除株高與分枝數測量外，其余各指標均測量4 個分枝并取其均值。

1.4 數據處理

采用Excel 2016 進行數據統計與制圖，SPSS 13.0 軟件進行單因素方差分析比較數據。

2 結果與分析

2.1 輻射對牛至種子發芽和成苗的影響

100 Gy 輻照劑量的60Co-γ 射線對牛至種子發芽率、發芽勢和發芽指數均沒有顯著抑制作用(P＞0.05) (表1)，但更高的輻射劑量顯著抑制了牛至種子萌發(P＜ 0.05)，且隨輻射劑量的增大，抑制作用顯著增加，牛至種子發芽率、發芽勢和發芽指數呈顯著降低的趨勢(P＜ 0.05)。輻照處理還推遲了牛至種子的發芽時間(圖1)，對照和100～200 Gy 輻射劑量處理的種子在第4～5 天時發芽最多，400～800 Gy 劑量處理的種子在第5～6 天時發芽最多，而1 600 Gy 劑量處理導致第7 天時才達到發芽高峰期。根據種子發芽情況，以發芽率為因變量(y)，輻射劑量為自變量(x)，得到發芽率與輻射劑量的線性回歸方程y= -0.000 6x+ 0.649 9，并將對照發芽率的一半(即37.6%)帶入方程，得到半致死輻射劑量LD50為539 Gy。

表1 輻照劑量對牛至種子發芽指標的影響Table 1 Effects of irradiation dose on germination index of oregano seeds

圖1 60Co-γ 射線對牛至每天發芽數的影響和發芽率-輻射劑量回歸方程Figure 1 Effect of 60Co-γ rays on number of germinating oregano seeds and regression equation between germination rate and radiation dose

此外，輻照處理后牛至種子在萌發后胚根生長受抑制，根系發育緩慢，導致萌發后幼苗在育苗基質內成活率低，幼苗早期生長緩慢。與對照的田間成苗率(58.20%)相比，100 Gy 輻照劑量導致田間成苗率下降(39.00%)，200 Gy 劑量導致田間成苗率降至1.85%，更高劑量輻照處理的種子萌發后無法在育苗基質中成活。

2.2 牛至突變體篩選

將輻射誘變后的牛至種子苗移栽至大田，共獲得8 170 株M1群體。將同一時期萌發、未經輻射處理的1 000 株牛至作為對照，觀察、記錄對照群體和M1單株的表型特征，并扦插擴繁M1群體內具有明顯表型變異特征的單株。

對照株系的株高32～46 cm，分枝數18～34，葉片翠綠至深綠色，第3 節間長8.9～10.4 mm，葉面積152～165 mm2(圖2)，傘房狀圓錐花序，多花密集，花白色。參考對照植株的表型特征，將具有明顯色澤變化或超過可量化指標極值10%的株系作為M1代突變體，包括高桿和矮桿突變體型、多分枝和少分枝突變體、葉型(葉片大小和形狀)、葉色及花色突變體等(表2)。這些突變體在扦插擴繁后仍能保持相應變異特性，說明變異特征與立地土壤或水肥條件無關，均為遺傳變異導致的突變性狀。

表2 輻射突變群體的突變類型及評判標準Table 2 Mutant types and trait evaluation standard in the radiation mutagenized population

圖2 部分希臘牛至突變體的株高、分枝、葉面積和節間長度Figure 2 Greek oregano mutants with typical variations of plant height, branching, leaf area, and internode length

株高變異體：根據1 000 株對照牛至的株高生長范圍(32～46 cm)，將株高 ＞ 51 cm 或 ＜ 29 cm 的株系定為高桿或矮桿突變體。例如， F-19 株高達到59 cm，而F-11 株高僅17 cm，與對照株系株高均值(39 cm)差異明顯(圖2)。

莖節長度突變體：短莖節突變體F-31 的平均莖節長較對照縮短了40.3%，而長莖節突變體F-34 較對照增長了166.0% (圖2)。

分枝突變體：根據對照牛至的分枝數范圍(18～34 個)，將分枝數 ＞ 37 或 ＜ 16 的株系定為多分枝或少分枝突變體。例如，多分枝突變體F-57 的分枝數達到39 個，而少分枝突變體F-34 僅有9 個分枝，與對照株系分枝(21 個)差異明顯(圖2)。

葉色變異體：在M1突變群體中，還發現具有葉色黃化變異株系3 株，紅色變異株系1 株(圖3)。

圖3 典型葉色變異突變體Figure 3 Typical leaf color mutants

大葉及小葉突變體：在突變體群體中，還篩選到具有明顯葉片大小變化的突變體(圖4)。以自上而下第3 節間基部舒展葉為例，對照株系的葉面積為124.66 mm2，葉長在10～23 mm，平均值為14.34 mm，葉寬在9～19 mm，平均值為11.07 mm；而大葉突變體F-19 的葉面積達到287.02 mm2，葉長達到22.63 mm，葉寬達到16.13 mm；小葉突變體F-33 的葉面積僅77.24 mm2，葉長僅10.10 mm，葉寬僅9.10 mm，與對照株系差異顯著(P＜ 0.05) (表3)。

表3 輻照處理導致牛至葉長、葉寬、葉面積發生變化Table 3 Irradiation treatment causes changes in oregano leaf length, leaf width, and leaf surface area

圖4 典型葉片大小突變體Figure 4 Typical leaf size of the mutants

3 討論

60Co-γ 射線誘變是最安全高效的誘變技術之一，被廣泛應用于植物的誘變育種中。例如，對水稻(Oryza sativa)品種‘圣稻15’進行誘變并通過篩選和鑒定獲得93 份表型突變較為明顯的突變體[19]；利用60Co-γ 射線輻照花生(Arachis hypogaea)的干種子，獲得高油突變體和高蛋白突變體[20]；利用60Co-γ射線對扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)處理發現，輻照后的大部分牛鞭草葉片趨于變小、株高趨于變矮、莖趨于變細[21]。另外，輻射誘變營養體或種子的再生植株易出現突變嵌合體[22-24]。本研究在牛至M1代突變體中的觀察發現，各突變體的變異表型在同一株的不同分枝較為一致，說明存在嵌合體的可能性小，這可能與牛至種子(胚)極小且選用較高的輻射劑量(100～200 Gy)有關，另外，本研究通過枝條扦插的方式擴繁變異株，進一步避免了輻射誘變可能導致的嵌合體問題。

高劑量輻射會抑制種子發芽率、生長勢和根系生長[25-28]。本研究結果表明，當輻射劑量超過200 Gy時，希臘牛至種子的發芽率、發芽勢和發芽指數隨輻射劑量的增大而顯著降低。雖然超過400 Gy 輻射劑量的種子仍能夠發芽，但萌發后的種子胚根尖部壞死，無法生成主根或產生側根，播種至育苗基質后，苗期即全部死亡。適宜的輻射劑量選擇與植物種類、種子大小、輻射部位及輻射材料的含水量關系密切。徐冠仁[29]認為致死劑量的60%～70%才是最佳輻射劑量；對桂花(Osmanthusfragrans)的研究認為，適宜的輻照劑量與品種有很大關系[30]；史燕山等[31]則以半致死和半致矮劑量為標準對晚香玉(Polianthes tuberosa)的種球進行輻照處理，確定了晚香玉大小種球的適宜輻照劑量。本研究通過發芽率-輻射劑量回歸方程計算得出牛至輻照的半致死劑量為539 Gy，與研究結果有較大的差異，半致死劑量不能作為牛至的適宜輻照劑量。結合本研究結果得出結論，希臘牛至輻照處理的適宜劑量應控制在致死劑量的18.6%～37.1%為宜，這與其他植物輻射誘變研究的結論有較大差異，可能是由于希臘牛至種子極小，對60Co-γ 射線更加敏感。因此，適宜輻射劑量的選擇不能僅參照發芽率或發芽勢，還應綜合考慮輻射對幼苗生長發育的影響。

利用60Co-γ 射線輻射牛至種子的近期研究發現，在不同輻射劑量下處理40 粒種子，牛至的半致死劑量僅為16.39 Gy[32]。本研究的母本材料是自主篩選得到的希臘牛至優株，每個輻射劑量處理了約10 000 粒種子，在100～200 Gy 的輻照強度下獲得大量突變體材料，并在田間條件下篩選有顯著表型變異的突變體。本研究結果與閆一皓等[32]報道差異較大，可能與不同種子的基因型差異有關，也有可能與輻射處理種子數有關。

牛至生物產量的主要相關性狀包括株高、分枝數、莖節間長度和葉片大小等。由于牛至莖稈的精油含量低，葉片和花中的精油含量高，因此篩選大葉、莖節短(葉片量相對更大)、植株高大、分枝多以及開花量大的突變株系是的牛至主要育種目標。通過輻射誘變獲得具有上述表型的牛至突變株，為培育高生物產量和高精油含量的牛至品種奠定基礎。但該研究結果僅為當年數據，雖然該數據能較準確地反映變異株的典型特征，但還需多點、多年研究進一步明確變異特征。具有優異特征的牛至突變株(如大葉突變株)可以通過營養體扦插擴繁，現有結果表明上述突變性狀均能在扦插后代中穩定保持。因此，上述部分突變體不僅能夠為牛至雜交選育提供母本材料，而且具有作為新品種推廣應用的潛力。

4 結論

60Co-γ 射線輻照希臘牛至種子可以有效獲得突變群體。牛至種子小，在較低輻射劑量下(100～200 Gy)能夠產生具有優異特征的突變體。通過扦插繁殖突變體單株或單個分枝，能夠快速穩定突變株的優異性狀。此方法簡單易行，創建的突變體庫為牛至新品種培育奠定了基礎。