心外膜脂肪中巨噬細胞對快速心房起搏犬心房KCa3.1及心房顫動易感性的影響

曹真 劉弟世聞 付韞韜 陳慧宇 趙慶彥

心外膜脂肪是一種代謝活躍的內分泌脂肪庫，由冠狀動脈分支供血，位于心肌和內臟心包之間，與心肌直接毗鄰。有研究發現心外膜脂肪為心肌炎癥及纖維化因子旁分泌調節的來源，可影響心房重構的產生[1-4]。臨床上也發現心房顫動(簡稱房顫)患者心外膜脂肪的高炎癥活性[5]，心外膜脂肪的炎癥活性與巨噬細胞浸潤程度一致[6]。巨噬細胞釋放多種炎癥和纖維化因子，在房顫的電重構和結構重構中發揮重要作用[7]。與非房顫患者相比，房顫患者心外膜脂肪標本中存在巨噬細胞大量聚集，提示房顫的病理生理機制可能與心外膜脂肪中的巨噬細胞相關[3,8]。KCa3.1是一種由KCNN4基因編碼的中電導鈣離子激活鉀通道，在心肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等多種細胞表面表達，參與如心肌細胞自律性、心肌成纖維細胞增殖及巨噬細胞遷移極化等多種功能的調節[9-11]。我們在前期研究中發現快速心房起搏犬心房中KCa3.1表達上調，抑制KCa3.1可明顯降低快速心房起搏導致的房顫易感性增加[12]，但在房顫發生過程中KCa3.1表達上調是否與心外膜脂肪中巨噬細胞浸潤相關尚不清楚。本研究通過快速心房起搏探討犬心外膜脂肪局部巨噬細胞浸潤對相鄰心房肌組織中KCa3.1及房顫易感性的影響。

材料與方法

1.材料：比格犬[湖北逸摯誠生物科技有限公司，許可證號：SCXK(鄂)2016-0020，體質量8～10kg]、戊巴比妥鈉(Aspen，中國)、氯膦酸二鈉脂質體(Vrije Universiteit Amsterdam，荷蘭)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)脂質體(Vrije Universiteit Amsterdam，荷蘭)、多極電極導管(Biosense-Webster,加拿大)、計算機電生理系統Lead7000(晉江公司，中國)、HRP標記山羊抗小鼠二抗CY3(Aspen，中國)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Aspen，中國)、BCA蛋白質濃度測定試劑盒(Aspen，中國)，一抗均購自于Aspen，包括CD68、血管緊張素Ⅱ受體-1(AT1R)、磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)、c-Fos、c-Jun及KCa3.1。

2.方法

(1)動物模型制備：18只比格犬飼養于武漢大學人民醫院動物實驗中心。采用戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈推注麻醉比格犬，予以氣管插管、機械通氣和連續心電監測。額外靜脈追加戊巴比妥鈉1 ml/h以維持實驗過程中的動物麻醉狀態。靜脈滴注生理鹽水(50～100 ml/h)以補償自發的液體丟失。將18只犬隨機分為空白組、起搏組和清除組，每組6只。清除組及起搏組犬在無菌條件下于第4肋間逐層雙側開胸，剪開心包以暴露心臟，在左心房和右心房縫制多極電極導管用于快速心房起搏及記錄。清除組犬在右肺靜脈-左心房脂肪墊、下腔靜脈-左心房脂肪墊與上腔靜脈-主動脈根部脂肪墊注射氯膦酸二鈉脂質體(5 mg/ml，每個部位0.5 ml)以清除巨噬細胞，起搏組犬在相同的部位注射等劑量的PBS脂質體作為對照。隨后給予起搏組及清除組犬快速心房起搏(600次/min，持續7 h)。

(2)電生理學指標測量：分別于起搏前和起搏后1、3、5、7 h測量左心房和右心房的心房有效不應期(AERP)。AERP采用程序期前刺激法(S1S2)進行測量，每8個基礎S1起搏刺激后，發放一個期前刺激S2,S1S2的偶聯間期以2 ms遞減。在起搏前及起搏7 h后，使用S1S1程序刺激法(120 ms、100 ms和75 ms周期長度，每次5 s，每頻率執行3次，即每只犬于3個起搏周長共完成9次程控刺激)誘發房顫。房顫定義為持續時間>5 s的絕對不規則的心房節律，頻率>500次/min。記錄各組中每只犬的房顫誘發次數，統計各組平均房顫誘發次數。記錄各組中每只犬每次誘導出房顫的持續時間，并計算每只犬的平均房顫持續時間，用以統計各組房顫持續時間,所有數據均由計算機電生理系統記錄。

(3)巨噬細胞浸潤水平評估：實驗結束后，收集心外膜脂肪組織和其覆蓋的毗鄰心房肌組織。部分置于4%多聚甲醛中固定，過夜后取出，制備常規石蠟切片，部分置于-80 ℃冰箱中待檢。采用免疫熒光法檢測心外膜脂肪中巨噬細胞浸潤水平，將心外膜脂肪樣本與CD68的一抗(1∶50稀釋)進行孵育，然后將其與二級抗體熒光素(CY3)標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG(1∶50稀釋)進行孵育，并用DAPI對細胞核進行染色。于熒光顯微鏡下觀察心外膜脂染色情況，在每組中隨機選擇來自不同犬的4個樣本，用于計算3個不同視野中巨噬細胞數量的平均數，使用Image J軟件分析結果。

(4)蛋白質免疫印跡法檢測心外膜脂肪組織中CD68及其毗鄰心房肌組織中AT1R、P-p38MAPK、c-Fos、c-Jun、KCa3.1表達水平：將心外膜脂肪組織和心房肌組織分別研磨后收集總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離總蛋白并將分離后的蛋白質轉移到PVDF膜上，在膜上添加CD68(1∶1 000稀釋)、AT1R(1∶500稀釋)、p-P38MAPK(1∶500稀釋)、c-Fos(1∶1 000)稀釋、c-Jun(1∶500稀釋)和KCa3.1(1∶1 000稀釋)的一抗并在4 ℃下孵育過夜，洗滌后在37 ℃下與HRP標記的二抗孵育1 h。采用蛋白凝膠成像儀進行拍照和灰度分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度/相對內參灰度。

結 果

1.3組犬心外膜脂肪中CD68標記的巨噬細胞浸潤水平及CD68水平比較：免疫熒光分析結果顯示，空白組、起搏組、清除組犬心外膜脂肪中CD68標記的巨噬細胞浸潤水平分別為5.00±4.24、228.25±65.41、45.25±27.90，其中起搏組高于空白組，清除組低于起搏組(P<0.001)，而空白組和清除組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。蛋白質免疫印跡法檢測結果顯示，空白組、起搏組、清除組犬心外膜脂肪組織中CD68水平分別為0.12±0.05、0.77±0.06、0.42±0.17，其中起搏組高于空白組，清除組低于起搏組，清除組高于空白組(P<0.001)。

圖1 3組犬心外膜脂肪組織中巨噬細胞浸潤水平：CY3標記的CD68被染成紅色，DAPI標記的細胞核被染成藍色(A、B、C分別為空白組的DAPI、CD68、Merge；D、E、F分別為起搏組的DAPI、CD68、Merge；G、H、I分別為清除組的DAPI、CD68、Merge；免疫熒光染色，×200)

2.起搏組和清除組犬左右心房不同時間AERP及房顫易感性比較：起搏組犬左心房和右心房1、3、5、7 h的AERP均短于0 h(P<0.05)。清除組左心房和右心房5、7 h的AERP均短于0h(P<0.05)。清除組犬左心房1、3、5、7 h的AERP均長于起搏組同一時間，清除組犬右心房3、5、7 h的AERP均長于起搏組同一時間(P<0.05)。見表1。起搏前，起搏組和清除組犬均未誘發出房顫。起搏組犬7 h房顫誘發次數高于基線[(5.3±2.5)次比0次，P<0.001]，而清除組犬7 h與基線房顫誘發次數比較差異無統計學意義[(1.3±0.5)次比0次，P>0.05]。清除組犬房顫誘發次數低于起搏組[(5.3±2.5)次比(1.3±0.5)次，P<0.001]，且清除組犬房顫持續時間低于起搏組[(7.4±3.0)s比(22.7±18.6)s，P<0.05]。

表1 起搏組和清除組犬左右心房不同時間AERP比較

3.3組犬心外膜脂肪鄰近心房肌組織中AT1R、p-P38MAPK、c-Fos、c-Jun及KCa3.1表達水平比較：3組犬心外膜脂肪鄰近心房肌組織中AT1R、p-P38MAPK、c-Fos、c-Jun及KCa3.1表達水平比較差異均有統計學意義(P<0.001)，其中起搏組高于空白組，清除組低于起搏組(P<0.05)。見表2。

表2 3組犬心外膜脂肪鄰近心房肌組織中AT1R、p-P38MAPK、c-Fos、c-Jun及KCa3.1表達水平比較

討 論

既往研究發現，相較于皮下脂肪，心外膜脂肪與房顫的發生及發展更為相關[6]，影像學檢查提示心外膜脂肪與其相鄰心房肌在病理改變上密切相關[13]。但心外膜脂肪與房顫病理生理機制之間的關系仍未完全闡明。我們前期研究發現快速心房起搏犬心房中KCa3.1的表達上調，抑制KCa3.1可逆轉快速心房起搏犬的心房電重構及降低房顫易感性[12]。進一步研究還發現，KCa3.1表達上調影響巨噬細胞的招募極化，導致巨噬細胞分泌的多種炎癥因子如白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達增加[14]。IL-1β抑制心房肌顫動蛋白(QK1)的表達，使L型鈣通道電流減少，進而導致心房電重構[15]。最近的一項研究提示編碼KCa3.1的KCNN4基因上調主要歸因于巨噬細胞聚集極化，巨噬細胞通過激活KCa3.1和縫隙鏈接導致動作電位時程異質性及心肌梗死后心律失常[16]。巨噬細胞聚集對房顫過程中心房組織KCa3.1表達的影響尚不清楚。有研究發現，在房顫患者心外膜脂肪標本中，巨噬細胞在心肌和脂肪組織交界處大量聚集[8]。本研究證實了巨噬細胞在快速心房起搏犬心外膜脂肪中大量浸潤，進一步發現使用氯膦酸二鈉脂質體清除局部心外膜脂肪組織中的巨噬細胞后，臨近心房肌組織中KCa3.1的表達水平上調及房顫易感性的增加被抑制。此前有研究結果顯示，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于AT1R激活P38MAPK、細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路，從而上調激活蛋白-1(AP-1，由c-Fos和c-Jun組成的轉錄因子)導致KCa3.1的表達水平升高[11]。與其一致的是，本研究發現快速心房起搏犬心外膜脂肪臨近心房肌組織中AT1R、P38MAPK及AP-1表達水平升高，而心外膜脂肪的巨噬細胞清除后，AT1R、P38MAPK及AP-1表達的上調均被抑制，提示心外膜脂肪中巨噬細胞可能與臨近心肌中AT1R/P38MAPK/AP-1途徑的KCa3.1激活相關。近期有研究發現，血管緊張素轉換酶2(ACE2)在心外膜脂肪組織細胞外基質增厚部位的表達增加[3]。而ACE2基因敲除小鼠的心外膜脂肪炎癥程度加重，常駐脂肪組織巨噬細胞的浸潤增多，提示局部腎素-血管緊張素系統(RAS)與心外膜巨噬細胞浸潤相關[17]。經典RAS途徑(AngⅡ/AT1R)的激活和非經典RAS途徑(Ang1-7/Mas1R)的抑制可能通過巨噬細胞相關炎癥/心外膜脂肪代謝改變/心臟電重構機制參與房顫的誘發和維持[18]。巨噬細胞相關的局部炎癥微環境影響脂肪組織的代謝及活化，促進循環血管緊張素原的釋放，產生和分泌AngⅡ，激活AT1R誘導自分泌和旁分泌效應，從而影響循環和局部的RAS[19-20]。本研究發現，心外膜脂肪巨噬細胞浸潤與相鄰心房肌組織中AT1R表達相關，為心外膜脂肪/巨噬細胞/局部RAS的關聯提供了證據。

綜上所述，快速心房起搏犬心外膜脂肪組織存在巨噬細胞大量浸潤，心外膜脂肪組織中巨噬細胞浸潤可能通過調控AT1R/P38MAPK/AP-1信號通路上調KCa3.1表達，從而增加快速心房起搏犬的房顫易感性。