骨關節炎與糖尿病的共同疾病基因及其相關微小RNA的篩選與鑒定▲

袁長深 官巖兵 容偉明 李 哲 梅其杰 延偉偉 段 戡

(1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院骨三科，南寧市 530023，電子郵箱：yuanchangshen0920@126.com；2 廣西中醫藥大學研究生學院，南寧市 530000)

骨關節炎是一種常見且難以逆轉的慢性退行性疾病，可導致患者疼痛、行走不便甚至殘疾，嚴重影響患者的生活質量。在全球范圍內，其發病率已達15%，且與日俱增，預計未來10年這一比例將上升為35%[1]。糖尿病是一種較為普遍的慢性疾病，其長期存在的胰島β細胞功能異常是胰腺癌發生的重要誘因，并給患者本身及社會帶來了巨大經濟負擔。全世界范圍內，已有4億以上的人口受糖尿病困擾，且人數逐年遞增，預估到2040年將高達6.5億[2]。近年來，骨關節炎與糖尿病合并發病的情況較為多見。流行病學研究顯示，糖尿病患者中骨關節炎的患病率和骨關節炎患者中糖尿病的患病率分別為29.5%和14.4%，糖尿病患者的骨關節炎總體風險為1.46，骨關節炎患者的糖尿病總體風險也達1.41[3]。不少研究人員表示兩者之間關系密切，甚至提出了糖尿病性骨關節炎的概念[4-6]。然而，也有部分學者對此持否認態度，認為二者并不存有相關性[7]。因此，明確兩者的潛在聯系，對骨關節炎及糖尿病的防治具有重要意義。

生物信息學是一門基于電子信息技術對生物醫藥領域進行相關研究的交叉性學科，可從基因分子的角度尋找疾病之間的潛在規律。因此，本研究基于生物信息學對骨關節炎與糖尿病的共同疾病基因及相關微小RNA(microRNA,miRNA)進行篩選鑒定與分析，為防治二者合并發病、減少糖尿病性骨關節炎患者提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 疾病相關基因的篩選 在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中分別以“osteoarthritis”“diabetes mellitus”為檢索詞，篩選出與骨關節炎相關的基因芯片數據集GSE55235及糖尿病相關的基因芯片數據集GSE29221。然后，通過GEO2R在線分析系統(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，對GSE55235中的10例對照組與10例骨關節炎組、GSE29221中的12例對照組與12例糖尿病組進行基因差異表達分析，并下載系統生成的后綴名為“csv”格式文件，將后綴名改為“xls”格式，以Excel表格形式打開并刪除重復項與空缺值，最后再以同時滿足P≤0.05和|log2FC|≥1為篩選條件，篩選出骨關節炎及糖尿病的差異表達基因(differentially expressed gene,DEG)。

1.2 篩選共同疾病基因 通過R軟件包“VennDiagram”對骨關節炎及糖尿病相關DGE進行分析并取交集，建立韋恩圖，以獲得共同疾病基因。

1.3 共同疾病基因的富集分析 將得到的共同疾病基因輸入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(Gene Ontology,GO)分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析，保存結果并進行可視化輸出。

1.4 PPI網絡的創建及關鍵基因的篩選 在STRING(https://string-db.org/)數據庫中，以綜合評分≥0.4為限制條件，創建共同疾病基因的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡,然后進行網絡拓撲分析，并采用Cytoscape軟件所附帶的“cytoHubba”插件中的Closeness、Degree、Bottleneck及MNC等4種不同計算方法分別挖掘出得分最高的前10位基因，取交集后獲得Hub基因。

1.5 Hub基因相關miRNA的預測 將Hub基因依次導入miRNet(https://www.mirnet.ca/)數據庫內獲得Hub基因相關miRNA，然后可視化呈現Hub基因及相關miRNA的網絡調控關系，并篩選出與4個Hub基因的相關性程度綜合排名位列前5的關鍵miRNA。

2 結 果

2.1 骨關節炎和糖尿病的共同疾病基因 對骨關節炎基因芯片GSE55235及糖尿病基因芯片GSE29221進行分析，得到骨關節炎相關DEG共1443個(上調基因525個，下調基因920個)，糖尿病相關DEG共1 176個(上調基因919個，下調基因257個)，見圖1。利用R語言軟件包“VennDiagram”將獲得的二者相關DEG取交集，共獲得148個共同疾病基因，見圖2。

圖1 骨關節炎和糖尿病相關DGE的篩選結果

圖2 Venn圖

2.2 GO和KEGG富集分析結果 通過DAVID數據庫對共同疾病基因進行GO和KEGG富集分析，發現其在GO富集分析的生物過程模塊中主要富集在腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的細胞反應、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)組織、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)刺激的細胞反應等;在細胞成分模塊中主要富集在ECM、膠原三聚體、蛋白細胞外基質等；在分子功能模塊中主要富集在肝素結合、血小板衍生生長因子結合、蛋白質同源二聚活性等。在KEGG富集分析中發現其主要富集在磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號通路中。見圖3及圖4。

圖3 GO富集分析結果

圖4 KEGG富集分析結果

2.3 PPI網絡構建及關鍵基因篩選結果 采用STRING數據庫建立共同疾病基因的PPI網絡后，通過網絡拓撲分析并利用4種不同計算方法分別篩選出得分前10位的基因，進行交集后得到4個Hub基因：CD44、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)、C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5,CCL5)及Ⅰ型膠原α2鏈(collagen type Ⅰ alpha 2 chain，COL1A2)。見表1和圖5。

表1 4個Hub基因在4種不同算法的得分(分)

圖5 4種算法篩選得到基因的交集圖

2.4 4個Hub基因相關miRNA的預測 通過miRNet數據庫預測4個Hub基因的相關miRNA，共發現359個有關的miRNA，篩選出綜合排名位列前5的關鍵miRNA，分別為miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p、miRNA-29c-3p，見表2及圖6。

表2 5個關鍵miRNA的信息

圖6 Hub基因與上游miRNA的網絡調控圖

3 討 論

臨床上骨關節炎與糖尿病合并發病并不少見，但二者的相關性仍存有爭議[8]。因此，本研究從生物分子學層面挖掘出骨關節炎與糖尿病的共同發病基因及其相關miRNA，以明確二者的潛在聯系，從而預防糖尿病性骨關節炎。

本研究通過GEO數據庫及GEO2R的在線分析工具共得到148個可同時存在于骨關節炎與糖尿病中的共同疾病基因，經GO及KEGG富集分析發現這些共同疾病基因主要富集在TNF、ECM、FGF等相關生物功能及PI3K/Akt與MAPK等信號通路中。(1)TNF與骨關節炎、糖尿病的關系：TNF-α作為TNF家族中重要組成部分，可間接參與骨關節炎的調控，其介導的白細胞介素34表達水平與膝骨關節炎滑膜炎的嚴重程度呈正相關[9]；而在1型糖尿病中，高表達狀態的TNF-α往往預示著血糖的控制情況并不理想[10]。(2)ECM與骨關節炎、糖尿病的關系：對2型糖尿病而言，脂肪細胞代謝障礙是其發病的重要誘因，而ECM又是損害脂肪細胞部分代謝功能的關鍵因素[11]；對骨關節炎而言，ECM合成與降解的失衡狀態可造成關節軟骨的破壞，并可作為判斷其發生的重要標志[12]。(3)FGF與骨關節炎、糖尿病的關系：FGF的不同亞族在骨關節炎及糖尿病中可發揮不同的調控作用。例如，在骨關節炎中，FGF18可增加膠原Ⅱ的沉積并抑制基質金屬蛋白酶13的表達而減輕軟骨的降解[13]；在糖尿病中，FGF21可降低血糖及改善代謝狀況，并能減輕各種相關并發癥的損傷[14]。(4)PI3K/Akt、MAPK信號通路與骨關節炎、糖尿病的關系：抑制PI3K/Akt傳導途徑能有效改善骨關節炎中關節軟骨的變性[15]，但會誘發胰島素抵抗而引發2型糖尿病[16]。p38-MAPK通路作為MAPK通路的關鍵成員，抑制該通路可抑制骨關節炎軟骨細胞的凋亡和促炎細胞因子的表達[17]，同時可抑制活性氧的產生及炎性介質的釋放，從而通過調節RAS系統來顯著延緩糖尿病腎病的進展[18]。

本研究進一步對PPI網絡通過拓撲分析，并利用4種不同計算方法分別篩選出得分前10位的基因，再進行交集獲得4個Hub基因，即CD44、IGF1、CCL5及COL1A2。CD44不僅可以破壞軟骨細胞與ECM的相互作用關系，在膝骨關節炎關節軟骨中呈高表達水平[19]，而且還可以導致胰島素抵抗，其表達水平在糖尿病患者的血漿中上調[20]。IGF1是維持軟骨平衡狀態的重要因素，有望成為骨關節炎的治療靶點[21]；其還與糖尿病的患病風險呈U形關聯，即較低或較高的IGF1水平能明顯增加糖尿病的患病概率[22]。CCL5不僅可以誘導多種基質金屬蛋白酶及一氧化氮合酶的表達，從而引起骨關節炎中軟骨ECM的降解[23]，而且還是1型糖尿病等免疫相關性疾病發病的重要因素,同時其表達水平的上調可能是1型糖尿病及其相關并發癥發生的預測指標[24]。由此可見，CD44、IGF1及CCL5在骨關節炎及糖尿病中的重要調控作用，但目前尚未見有研究報告COL1A2同時在二者中發揮作用。

最后，通過對4個Hub基因進行相關miRNA預測，獲得排名前5的miRNA：miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p、miRNA-29c-3p。查閱相關文獻后發現，miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p與miRNA-34a-5p在骨關節炎中分別起著不同的調控作用；然而在糖尿病中，卻尚未發現上述miRNA能直接參與血糖的調控機制，但在糖尿病腎病中卻扮演著重要的角色。(1)miRNA-26a-5p：促進miRNA-26a-5p的表達會抑制陽離子轉運蛋白樣蛋白1/核因子κB通路，以防止腎小管上皮細胞的炎癥反應并延緩糖尿病腎病的發展[25]；在骨關節炎中，來源于人骨間充質干細胞的外泌體中的miRNA-26a-5p過表達會下調前列腺素內過氧化物合酶2的表達，延緩骨關節炎的進展[26]。(2)miRNA-27a-3p：研究表明，FOXD2-AS1的過表達會誘導骨關節炎軟骨細胞發生炎癥反應及軟骨ECM出現降解，但miRNA-27a-3p可以逆轉這一現象[27]；而在調控糖尿病腎病方面，miRNA-27a-3p則會引起腎纖維化、線粒體功能障礙和內質網應激反應來參與糖尿病腎病的發生[28]。(3)miRNA-98-5p：miRNA-98-5p不僅能通過靶向調控高遷移率族蛋白A2減輕上皮間質轉化和腎纖維化進而延緩糖尿病腎病的進程[29]，而且其表達量的減少亦是導致骨關節炎軟骨細胞凋亡的重要因素[30]。(4)miRNA-34a-5p：miRNA-34a-5p能抑制在腎間質纖維化演變中起重要作用的沉默信息調節因子1的表達，作為糖尿病腎病治療的新靶點[31]；此外其在骨關節炎中呈高表達狀態而破壞關節軟骨穩態[32]。但是miRNA-29c-3p在骨關節炎及糖尿病中的調控作用，目前尚未見有相關研究報告。

綜上所述，CD44、IGF1、CCL5及其對應的miRNA-26a-5p、miRNA-27a-3p、miRNA-98-5p、miRNA-34a-5p同時在骨關節炎及糖尿病中發揮重要的調控作用。由此可見，骨關節炎和糖尿病之間存在潛在聯系，這或可為今后防治糖尿病性骨關節炎提供一定的理論基礎。但本研究方法也有不少不足之處，例如選取的基因芯片包含的樣本數量不夠大，以及只是單純在理論層次上進行研究，而缺乏相關的體內外實驗加以佐證等。