VNTR分子標記在甜菜細胞質類型鑒定的應用研究

張 輝，王 良，付增娟，李曉東，趙尚敏，鄂圓圓，鄭文哲，張自強，張必周，張惠忠

（內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古呼和浩特 010031）

甜菜是二年生常異花授粉作物，是重要的蔗糖榨取原料。二年生作物的生育周期較長，制約了育種工作進程。線粒體是起源于α-變形菌門的內共生細胞器[1]；雖然線粒體擁有自己的基因組，但其遺傳信息不足以維持線粒體的功能，需要大量的核基因進行相互作用[2]；不適當的線粒體-核相互作用可表現在壽命、雌性配子體發生或雄性配子體發生等過程[3-5]；線粒體-核相互作用對雄性配子體發生的影響已經在植物中得到了廣泛研究，被稱為細胞質雄性不育（CMS）[6]。目前，已在150 多種植物中發現了CMS[7]。CMS 的表達可以用一個遺傳模型來解釋，線粒體因子S 為“不育”，雄性不育與核因子Rf（恢復基因）相互作用，其顯性等位基因抑制S 的作用。在這個遺傳模型中，雄性不育只有在植物的非恢復等位基因時才能表達，基因型為［S］rfrf。在基因組中可能存在一個或多個Rf 基因[8]。例如，CMS-T 是玉米的3 種CMS 類型之一，需要Rf1（或另一個等效基因）和Rf2 恢復生育能力[9]。此外，當花粉育性分離復雜時，還提出一種本身不能恢復花粉育性但能修飾Rf 作用的修飾基因。DUVICK[10]在一些與玉米CMS-T相關的交叉試驗中提出了修飾基因參與了生育能力恢復。因此，一些次要基因可能參與了CMS 的表達，這意味著CMS 處于一個復雜的遺傳系統的控制之下。CMS 是農業中的一個重要特征，因為它為大規模雜交種子生產提供了理想的種子親本[11]。甜菜生產上使用的商業品種也是利用CMS 配制雜交種。甜菜育種者大量使用了OWEN[12]發現的細胞質雄性不育型材料（Owen 型不育系）。由于CMS 植物不能自花傳粉，它們的繁殖需要與CMS 株系具有相同的核基因型且沒有任何顯性Rf 基因的親本維持繁殖，但由于該親本的線粒體基因育性正常，這種親本被稱為保持系，基因型為[N]rfrf。如果某植物和該CMS 植物雜交后的所有F1是雄性不育的，則該植物是保持系。

在甜菜育種工作中，不育系的利用能大大提高雜交育種的效率。通常在花期進行育性調查進而對保持系和不育系材料進行有效選擇。但在調查過程中難免存在漏查和誤查，從而導致后代選擇的材料出現不純現象。NISHIZAWA 等[13]開發出線粒體基因組里的TR1、TR2、TR3 和TR4 特異引物，發現線粒體基因組有4 個數目可變串聯重復序列（VNTR）位點，在7 個基因型的甜菜中被檢測出存在2～13 個不同的重復數。CHENG 等[14-15]利用VNTR分子標記的方法對42 個中國甜菜育種系正常和雄性不育型細胞質進行了鑒定分析，對不同的細胞質類型進行了梳理分類，并利用該技術對葉用和觀賞甜菜種質資源的多樣性進行了鑒定，鑒定出11 個多位點單倍型，總結了不同類型的細胞質類型特點。分子標記輔助選擇技術的應用可以大大提高育種效率和數據準確性，本研究將已開發的VNTR 特異引物應用于二年生甜菜保持系和不育系胞質類型鑒選，旨在為提高甜菜育種效率、加速育種進程提供理論指導和技術支持。

1 材料和方法

1.1 供試材料

內蒙古自治區農牧業科學院自育或引進的甜菜材料40 份（表1），其中保持系960767 和不育系N9849 已經過多年田間調查驗證，并經過分子鑒定應用[16]，為已成型穩定的成對保持系和不育系材料。其他鑒定材料為經過田間性狀調查待鑒定胞質類型的材料，其中，材料1～21 擬選為不育系材料、22～40 擬選為保持系材料。

表1 試驗材料名稱情況

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣和DNA 的提取

取樣：每份材料各取10 株，在苗期取甜菜植株中心的新鮮幼嫩葉片2～3 片，稱重0.8～1.2 g。將取樣后的新鮮嫩葉置于超低溫冷凍干燥機凍干48 h，將干燥后的樣品分裝置于2 mL 的離心管中，然后裝入鋼珠，用高通量破碎機將葉片打碎成粉末，之后即可用于DNA 的提取。凍干后的葉片可以在干燥的環境下長期保存。

DNA 的提?。哼x用新型植物基因組DNA 提取試劑盒（天根），對已經進行破碎處理的葉片進行DNA 的提取，操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 DNA 的檢測

將提取后的DNA 樣品5 μL 與6 × Loading Buffer 緩沖液1 μL 預混后點樣5 μL，使用1%的瓊脂糖凝膠在1×TAE 的電泳緩沖液中進行電泳，電泳條件為120 V、30 min 左右。用凝膠成像系統紫外光檢測電泳結果。

1.2.3 PCR 擴增

TR1引物：5′-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3′，5′-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3′；TR2 引物：5′-TTAATTGCGAGACCGGAGGC-3′，5′-GAGCTTGCTC GCAGCTTATG -3′；TR3 引物：5′-AGATCCAAACAG AGGGACTG-3′，5′-CGGATCACCCTATTCATTTG-3′；TR4 引物：5′-AATGAGACCCGATTCTCTTC-3′，5′-GTTAAAAGCCCTTCTATGCC-3′[17]。PCR反應體系：15.0 μL 體系，包括7.5 μL×2 Taq Master Mix，1.0 μL上游引物，1.0 μL 下游引物，3.0 μL DNA，2.5 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 PCR 擴增產物的檢測

將PCR 擴增后的產物點樣5 μL，使用1% 瓊脂糖凝膠1×TAE 的電泳緩沖液進行電泳。在100 V電壓下電泳30 min 左右，凝膠成像儀照相保存圖片。PCR 擴增產物回收及測序：選用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（天根），對不同引物PCR 擴增后的產物進行回收，回收產物由測序公司進行測序。

1.2.5 田間育性性狀調查

在甜菜開花始期（開花達到15%）進行田間性狀調查，調查內容為甜菜花藥的發育狀況，花粉粒的特征和散粉的能力。二年生甜菜育性類型分為5 類：全不育型、半不育一型、半不育二型、半可育型、可育型[18]，具體性狀類型見表2。

表2 花粉育性調查標準（5 級法）[19]

2 結果與分析

2.1 保持系和不育系材料不同鑒定引物檢測結果

選用內蒙古自治區農牧業科學院甜菜育種課題自育材料：保持系960767、不育系N9849。這對材料已經過多年田間調查驗證并經過分子鑒定應用，為已成型穩定的成對保持系和不育系材料。對已開發的TR1、TR2、TR3 和TR4 特異引物進行檢測，檢測結果見圖1，保持系960767 標注為O，不育系N9849 標注為CMS。TR1 特異引物檢測效果較其他特異引物差異更明顯，保持系材料PCR 擴增條帶位于750 bp，不育系材料PCR 擴增條帶位于500 bp。TR3 特異引物PCR 擴增條帶保持系材料位于500 bp，不育系材料PCR 擴增產物略小于保持系材料，但差異不明顯。TR2 和TR4 特異引物PCR 擴增產物顯示保持系和不育系材料差異不明顯。

圖1 保持系和不育系材料不同TR特異引物PCR 產物擴增效果

由圖2 可知，不同材料經TR1 引物PCR 特異擴增后差異明顯，重復性良好，經與成型和穩定的保持系和不育系材料鑒定比對材料960764 和N9857 細胞質類型為N1 型和Owen 型。

圖2 不同保持系和不育系材料TR1 特異引物PCR 產物擴增效果圖

由圖3 可知，細胞質類型為N2 型和Owen 型的保持系材料OT302 和不育系材料MS301 的PCR 產物擴增效果。

圖3 Owen型細胞質和N2型細胞質TR1 特異引物PCR 產物擴增效果

2.2 細胞質育性分子標記鑒定結果

試驗利用不同的TR 特異引物檢測了40 個試驗材料的400 個植株樣品。其中TR1、TR2、TR3、TR4 特異引物在Owen 型細胞質檢測后的串聯重復數為4、3、2、4。在N1 型細胞質檢測后的串聯重復數為13、3、3、3。在N2 型細胞質檢測后的串聯重復數為6、3、3、3。TR1 特異引物PCR 擴增產物Owen 型細胞質材料條帶位于500 bp，N1 型細胞質材料條帶位于750 bp，N2 型細胞質材料條帶位于500～750 bp。其中21 個擬入選不育類型的材料中檢測出符合Owen 型的材料有N9849-17-1、N9865-103-C1、N9857-5-1-TH1-400、MS321-C27-1-80、MS331-N70、MS343-80、MS117-3-6-4-2、MS301-500、MS351-80、MS327-70-80、MS333-70-80、MS335-N70、2068B-2、MS151-1-16-301-400、MS317-1-8-301、MS313-506-600、MS320-7-605-1-84（表3）。在擬入選不育類型的材料中檢測出MS329-N70、MS323-503-600分別為N1 型和N2 型細胞質。材料MS351-80-1 和MS341-80 檢測的材料結果并不完全一致，說明材料不純，需要進一步選擇純化。MS351-80-1 檢測了10 株，Owen 型細胞質類型7 株，N1 型細胞質1 株，N2 型細胞質2 株。MS341-80 總共檢測了10 株，Owen 型細胞質類型7 株，N2 型細胞質3 株。19 個擬入選可育型材料中檢測出符合N1 型細胞質的材料有960767-201TH-1、960764-1-11-1-1-400、OT322-C7-70-80、OT332-N70、OT352-80、OT328-70-80、BS301-13-9、OT352-80-1、OT342-80、OT152-1-6-301-400。N2 型細胞質的材料有OT302-500。在擬入選保持系材料中檢出Owen 型細胞質類型960766 -1077 -c1、OT344 -80、OT118 -4 -5 -4 -4、OT324-501-600（表4）。擬入選的保持系材料OT152-1-1-C301、OT330-N70、OT334-70-80 和OT336-N70 檢測的樣品結果不一致，OT152-1-1-C301 檢測了10 株，Owen 型細胞質類型2 株，N1 型細胞質8 株，OT330-N70 檢測的10 株中Owen 型細胞質類型3 株，N1 型細胞質7 株，OT334-70-80 檢測的10 株中N2 型細胞質3 株，N1 型細胞質7 株，OT336-N70 檢測的10 株中Owen 型細胞質類型6 株，N2 型細胞質4 株。這說明4 個材料不純，可以進一步套袋選擇進行純化。

表3 擬入選不育系材料檢測結果

表4 擬入選保持系材料檢測結果

2.3 田間育性性狀調查結果

根據表2 所列的花粉育性調查標準進行田間育性性狀調查，40 份試驗材料共調查400 個植株樣品，其中可根據調查結果將試驗材料分為以下幾類（表5），可育型包括：960767-201TH-1、960764-1-11-1-1-400、OT322-C7-70-80、OT332-N70、OT302-500、OT352-80、OT328-70-80、OT334-70-80、OT352-80-1、OT342-80、OT152-1-6-301-400、OT152-1-1-C301，這些材料均存在大量花粉并進行開裂；半可育型包括：960766-1077-c1、OT344-80、OT118-4-5-4-4、OT336-N70、BS301-13-9、OT330-N70、OT324-501-600，這些材料含有無受精能力的花粉粒及少量正常的花粉粒；全不育型包括：N9849-17-1、N9865-103-C1、N9857-5-1-TH1-400、MS321 -C27 -1 -80、MS331 -N70、MS343 -80、MS117-3-6-4-2、MS301-500、MS351-80、MS327-70-80、MS333-70-80、MS335-N70、MS351-80-1、MS341-80、MS151-1-16-301-400、MS317-1-8-301、MS313-506-600、MS320-7-605-1-84，這些材料無花粉，或含少數小孢子退化的花粉粒，花粉不開裂；半不育一型包括2068B-2，具有退化的小孢子或較之略發達的花粉粒，但不開裂；半不育二型包括MS329-N70 和MS323-503-600，這兩個材料均有花粉膜，可見花粉孔，含多個花粉粒，但無受精能力，花藥幾乎不開裂。田間調查結果對應分子鑒定結果960766 -1077 -c1、OT344 -80、OT118 -4 -5 -4 -4、OT324-501-600，均為半可育型，但鑒定其細胞質類型屬于S 型細胞質，根據歐文理論這些材料的細胞核基因應該含有可育基因X，這些材料在具體應用時不建議選作保持系材料。而MS329-N70 和MS323-503-600 屬于半不育類型，但鑒定其細胞質類型不屬于S 型細胞質，在選育過程中建議不用于不育系的選擇。

表5 不同試驗材料田間育性性狀調查結果匯總

3 討論與結論

甜菜育性基因主要是由細胞質和細胞核基因相互作用控制的?？勺償的看撝貜托蛄惺蔷哂懈叨冗z傳多態性和高度重復性的DNA 片段，其重復單位數目的可變性，是其長度多態性形成的主要機制。TOURMENTE 等[20]研究發現，可變數目的串聯重復序列（VNTRs）在真核生物基因組中豐富且普遍存在。VNTR 既存在于小衛星DNA 中，也存在于微衛星DNA 中。BUARD 等[21]研究發現了一般微衛星序列（重復單元的長度為5 bp 或更短）和微型衛星序列（重復單元的長度為5 ～100 bp）。由于命名習慣影響以及為了便于區分，通常小衛星DNA 中的可變數目串聯重復序列稱為VNTR，而把微衛星DNA 中的可變數目串聯重復序列稱為STR。VNTR 的重復單位長度一般在6～70 bp，重復次數為數次至數百次。CONKLIN 等[22]研究發現，植物線粒體基因組的一個基本標志是其重復序列重組的傾向。所有測序的重組重復序列沒有基因序列，這表明重組是通過同源機制而不是位點特異性機制發生的。不同小衛星在基因組中有特定的位置，就重復單位而言，它是多拷貝的，而對于特定基因座的片段長度等位基因而言，它又是單拷貝的。在同一基因座，每一個等位基因之間的長度差異剛好是重復單位的整倍數。不同座位的小衛星VNTR 序列間的核心序列有極髙的同源性。

甜菜線粒體基因組的可變數目串聯重復序列（VNTRs）位點的特異性為區分正常細胞質和雄性不育細胞質提供了可能[13，17，23]。本研究利用已開發VNTR 特異引物（TR1、TR2、TR3、TR4）對內蒙古自治區農牧業科學院選育過程中的40 份材料進行細胞質類型鑒定。結合這些材料的田間性狀調查，結果表明，4 個特異性引物中TR1 特異引物鑒定效果較好，TR1 特異引物PCR 擴增產物Owen 型細胞質材料條帶位于500 bp，N1 型細胞質材料條帶位于750 bp，N2 型細胞質材料條帶位于500～750 bp。這主要是因為N1 型細胞質經TR1 特異引物PCR 擴增后的串聯重復數為13，N2 型細胞質經TR1 特異引物PCR 擴增后的串聯重復數為6，Owen 型細胞質經TR1 特異引物PCR 擴增后的串聯重復數為4，因此擴增出來的N1 型和Owen 型條帶差異較大，N 型和Owen 型條帶差異較小。經分子鑒定結果不一致的材料6 份（MS351-80-1、MS341-80、OT152-1-1-C301、OT330-N70、OT334-70-80、OT336-N70），有待進一步純化選擇。其他材料分子鑒定結果與田間調查結果基本一致，雖有個別植株存在差異性條帶與材料不純和甜菜本身單株特異性較大有關。VNTR 特異引物的輔助選擇為甜菜保持系和不育系下一步的選育工作提供了方向和參考，為成對保持系和不育系的選擇提供分子水平的支撐。雖然該方法不能涵蓋所有的甜菜類型，但可結合田間選育做出較為準確的判斷，細胞核特異性引物的成功應用將更有效地推進分子輔助選擇在甜菜育種中的應用。