生物肥對螺螄養殖稻田底泥微生物數量的影響

鄭炳言，李威鋒，羅福廣，王志強，李艷和

（1.華中農業大學水產學院/水產養殖國家級實驗教學示范中心，武漢 430070；2.廣西柳州市漁業技術推廣站，廣西 柳州 545006）

近年來，廣西壯族自治區柳州市的“網紅美食”螺螄粉暴紅，螺螄粉的熱潮瞬間席卷了全國各地。螺螄粉食品產業的飛速發展也進一步帶動了其上游產業螺螄養殖業的發展。然而在螺螄養殖業不斷發展的同時，還存在一定的問題，如大規模螺螄養殖少、養殖技術條件落后、養殖戶思想觀念跟不上等［1］，導致螺螄出現供不應求、質量低等現象。而螺螄產量與質量一般會受其養殖環境的影響，如何改善螺螄養殖環境受到養殖戶們的高度重視。螺螄是一種底棲動物，其生命活動與土壤有著直接的聯系，所以改善土壤的環境能夠直接地影響到螺螄的生長狀態［2］。微生物是土壤生態系統中一個重要的組成部分，作為分解者，微生物參與了生態系統中的能量流動和物質循環關鍵的一環，其生命活動也影響了土壤的肥力和生產力［3，4］。土壤中細菌可以將一些有毒害作用的物質轉為含氮有機質等有用物質，同時將一些不可利用的物質分解為可利用物質等［5，6］。土壤中的放線菌和真菌可以分解纖維素、木質素和果膠等物質，分解的產物同樣也參與到土壤的物質循環中。放線菌和真菌的大量菌絲也可以松動土壤改善土壤的性質和土壤里的氧氣環境，促進植物根系對氧氣和營養物質的吸收［7］。土壤中的微生物對土壤環境的變化尤為敏感，所以其數量變化可以直觀地反映土壤環境和理化性質的改變。但是目前有關螺螄養殖環境中微生物的數量和群落結構的研究不夠充分，了解螺螄養殖稻田底泥微生物的數量變化和群落結構，對實際生產中掌握底泥生產力和肥力以及養殖動物的產量有著重要的意義。

本研究利用稀釋涂布平板法調查分析了養殖螺螄稻田在施肥前后底泥微生物的數量變化及種類鑒定情況，為養殖螺螄稻田生物肥的進一步施用提供前期數據和改進意見，為評價螺螄養殖稻田底泥微生物狀況及為水產養殖有益優勢菌的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣

底泥樣品來自里高鎮的養殖稻田。里高鎮位于廣西壯族自治區柳州市柳江區西南部。采集樣本的稻田有7塊，每塊稻田的面積為667 m2，在7塊稻田中（編號為1號、8號至13號試驗田），1號為不施生物肥，只投喂飼料，3 d喂1次，每次20 kg；8號至10號只施生物肥，首次施肥6 000 kg/hm2（2020年11月2日），其后每半個月追肥1 650 kg/hm2；11號至13號施生物肥，首次施肥6 000 kg/hm2，其后每半個月追肥1 650 kg/hm2（與8號至10號稻田施肥時間一致），且額外投喂飼料，3 d喂1次，每次300 kg/hm2。

每塊養殖稻田取新鮮表層底泥500～600 g，每塊稻田分5個點均勻取樣，采集后置于無菌封口袋中混勻、封口、貼好標簽，于泡沫盒中加冰冷藏保存。采樣次數為10次，采樣時間點分別是首次施肥后0、3、7、14、21、28、59、90、118、149 d。

1.2 樣品處理

從底泥樣品中均勻稱取0.4 g底泥置入5 mL EP管中，在超凈工作臺內，向其中加入3.6 mL ddH2O，在快速混勻器上振蕩使底泥充分溶解，使底泥均勻分散成為底泥懸浮液，在28℃、140 r/min條件下于振蕩培養箱振蕩20 min；靜置待混合液完全分層后在無菌條件下吸取1 mL上清液移入2 mL EP管中，此時的微生物懸浮液的稀釋倍數是101，靜置1 h；待懸浮液完全分層后吸取上清液0.2 mL至新的2 mL EP管中，加入1.8 mL ddH2O充分混合，此時的微生物懸浮液的稀釋倍數是102；搖勻，吸取0.2 mL于新的2 mL EP管中并加入1.8 mL ddH2O，以此類推至稀釋倍數為105。將上述不同稀釋倍數的菌懸液分裝好并置于4℃冰箱保存，做好標記，密封保存。

1.3 微生物分離與計數

土壤微生物數量測定采用平板菌落計數法。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基，真菌采用馬丁-孟加拉紅培養基，放線菌用高氏一號培養基。細菌、真菌、放線菌分別取10-3、10-1、10-2的濃度梯度［8］。全程在無菌環境下進行，向培養基中加入菌液后用涂布棒均勻涂布。接種完成后，用封口膜將培養皿密封，使用北京林帆康達儀器設備有限公司的SPX-150B智能型生化培養箱，在28℃恒溫下倒置培養（細菌24 h、真菌96 h、放線菌144 h）。培養完成后觀察分離菌株的菌落形態、大小、顏色、邊緣形態、是否隆起、光澤等特征，對單菌落進行計數、拍照并于4℃下進行封口冷藏保存。統計菌落數，并按下列公式計算活菌數量（CFU/g）。

1.4 微生物DNA提取與擴增

采用Lysis Buffer法提取菌株的DNA，對菌株的DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為25μL：正反引物各1μL，PCR Mix 2.5μL，ddH2O 17.25μL，dNTPs 1μL，Taq酶0.25μL，DNA模板2μL。細菌、放線菌采用原核生物16SrRNA通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）；真菌采用真核生物ITS序列引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）。PCR反應條件：94℃預變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個循環；72℃終延伸10 min；4℃保溫。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。PCR擴增產物直接送武漢擎科生物科技有限公司進行測序。

1.5 系統進化分析

根據16SrRNA序列（細菌、放線菌）、ITS序列（真菌）相似性分析和系統發育關系分析，鑒定該菌株所屬的種屬。從GenBank選取相近菌株的序列與測序序列用MEGA7.0軟件使用比鄰法構建菌株系統進化樹，對被鑒定菌株的分類地位進行進一步的分析。

1.6 數據分析與處理

采用Excel 2016軟件繪制微生物數量隨采樣時間變化的折線圖，采用SPSS23.0軟件對指標進行相關性分析和系統聚類分析。

2 結果與分析

2.1 稻田底泥微生物培養計數結果與數量變化

細菌的數量占有明顯的優勢，平均占比達97.32%。從圖1可以看出，第一次施肥過后（2020年11月2日），除1號稻田外各稻田底泥中的細菌數量有了明顯提升，1號稻田細菌反而減少了73.15%，而8號、9號、12號、13號稻田的菌落數分別上升了273.14%、307.73%、463.06%和63.00%，其中12號稻田的細菌數量上升幅度最為明顯（圖1，第2次采樣）。10號稻田細菌數量的增加滯后于其他稻田（圖1，第3次采樣）。施肥一段時間后，各稻田細菌數量出現一定的下降。在追肥后，各稻田的細菌數量大幅度增加，除8號稻田外均出現了最大值，1號稻田細菌數量最大值為2.19×107CFU/g，9號、10號稻 田 細 菌 數 量 最 大 值 分 別 為3.15×107、3.92×107CFU/g，11號、12號、13號稻田細菌數量最大值分別為3.20×107、2.47×107、3.84×107CFU/g（圖1，第5次采樣）。相比于前7次采樣的底泥細菌數量來說，后3次采樣底泥細菌的數量明顯減少，維持在較低水平，在一個較小的范圍內波動并趨于穩定。

圖1 施肥后各稻田底泥細菌的數量變化

真菌占稻田底泥微生物總數的0.82%，在第一次施肥之前，土壤中供真菌吸收的營養物質不足，而新的養分還未添加到稻田中，此時真菌數量處于一個較低水平。第一次施肥后除了9號、10號、12號稻田真菌數量增加以外，其他稻田的真菌數量均下降，漲幅最大的是9號稻田（圖2，第2次采樣），隨后1號稻田的真菌數量出現短暫的上升，其他稻田的真菌數量變化不大（圖2，第3次采樣）。在第一次追肥之后除1號、11號和13號稻田的真菌數量下降外，各稻田的真菌數量均增加，并出現了最大值，其中8號稻田的真菌數量上升最大，出現了峰值，達1.33×105CFU/g，其次是9號稻田的4.95×104CFU/g和10號稻田的4.49×104CFU/g（圖2，第5次采樣）。在追肥一段時間后，第6次采樣時各稻田的真菌數量出現下降，最后趨于平穩。

圖2 施肥后各稻田底泥真菌的數量變化

放線菌占稻田底泥微生物總數的1.86%。由圖3可以看出，第1次采樣時，放線菌數量最多的是13號稻田，為8.75×104CFU/g，其次是12號稻田的3.75×104CFU/g，說明這2塊稻田底泥中的初始放線菌數量較多。在第一次施肥后，1號、8號、10號稻田的放線菌數量出現了一定的增加，其中1號稻田放線菌數量增幅最大（圖3，第2次采樣）。相反，11號、12號、13號稻田的放線菌數量相較于施肥前出現了下降，但在施肥一段時間后緩慢上升（第3次采樣）。在追肥后除了1號和13號稻田的放線菌數量有所上升外，其他稻田的放線菌數量均出現了下降（圖3，第5次采樣）。但在追肥一段時間后（第6次采樣時），除13號稻田外，各稻田放線菌數量均上升，其中12號稻田放線菌數量上升至最高，為6.75×104CFU/g，其次是11號稻田的5.50×104CFU/g。在第7次采樣后，放線菌的數量變化與細菌、真菌數量變化趨勢相同。

圖3 施肥后各稻田底泥放線菌的數量變化

2.2 稻田底泥微生物數量的系統聚類分析

將7塊稻田的底泥微生物總數進行系統聚類分析，由聚類譜系（圖4）可以看出，7塊稻田可被分成2類，一類是10號稻田，另一類是1號、8號、9號、11號、12號、13號稻田；進一步細分成了3類，8號、9號、11號、12號、13號為一類，1號、10號稻田各為一類。

圖4 使用組間聯接的7塊稻田底泥微生物總數量的系統聚類譜系

2.3 稻田底泥微生物的鑒定

通過形態特征，結合分子手段，將培養出來的微生物進行鑒定分析。分析結果（圖5）顯示，鑒定出的細菌主要包括2個門，其中數量較少的一類是厚壁菌門（Firmicutes），多數為革蘭氏陽性菌，屬于G+C含量較低的一類細菌；共鑒定出屬于厚壁菌門的細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）3個屬。其中數量較多的一類細菌是變形菌門（Proteobacteria），這是一類革蘭氏染色呈陰性的細菌，因其形態變化多樣而得名，大多數營兼性或者專性厭氧及異養生活；其中包含假單胞菌屬（Pseudomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、食酸菌屬（Acidovorax）5個屬。真菌鑒定出1門（圖6），為子囊菌門（Ascomycota），這些真菌由于有性階段形成子囊和子囊孢子而得名，其中含1科叢梗孢科（Moniliaceae）1屬曲霉屬（Aspergillus）。

圖5 基于分離菌株的16Sr RNA基因序列同源性構建的系統發育樹

圖6 基于分離菌株的ITS序列同源性構建的系統發育樹

如表1所示，鑒定出的細菌中，優勢菌種為芽孢桿菌屬（56%～99%）和假單胞菌屬（15%～64%）。芽孢桿菌在培養基上呈現白色、圓形、有光澤、凸起的菌落形態，而假單胞菌呈現黃色、圓形、有光澤、凸起的菌落形態。真菌主要是曲霉，在培養基上呈輻射狀生長，中間呈黑色，周圍長出放射狀的類似毛玻璃的孢子群，且3個曲霉之間會形成明顯的分界線，不會發生重疊。放線菌從上方看主要是呈現粗糙、干燥的圓形菌落，中間凹、周圍凸。

表1 螺螄養殖稻田底泥微生物鑒定分類

3 討論

3.1 施生物肥對稻田底泥微生物數量的影響

施肥是農業生產中的一個重要的措施，通過施肥可以使得肥料中的物質與土壤成分相互作用，改善土壤生態環境和理化性質，促進作物的生長。土壤是一個復雜的生態系統，其中充滿著各種有機質、無機質、土壤酶以及土壤微生物，其中，微生物是一個非常重要的活性成分，土壤微生物的群落結構又可以間接反映土壤的肥力以及致病能力［9］。在土壤微生物中，細菌占有絕對的數量優勢，放線菌在土壤中的數量普遍也多于真菌，成為土壤微生物中的第二大類。本研究中，稻田底泥細菌的數量超過了稻田底泥微生物的97%，占絕對的優勢，這與曹延珺等［10］和譚宏偉等［11］以及Debosz等［12］的研究結果一致。大量研究表明，增施肥料是提高土壤肥力的主要途徑，施肥是通過改變土壤的理化性質，影響微生物的生存環境，從而提高了微生物的數量和活性［13-15］。羅莉等［16］研究發現施肥后土壤細菌和放線菌數量隨著處理時間的變化先升高后降低，而真菌則是呈逐漸降低的趨勢。本研究發現，在施肥后微生物數量總體上呈先迅速增加后緩慢減少的變化規律；在后期隨著每半個月一次的追肥，施肥對微生物的影響已經很小，微生物數量保持在較低水平，分析可能與生物肥的肥效和試驗后期土壤肥力等指標的變化有關?？梢酝ㄟ^增加追肥頻率或者增加追肥量或者提高肥料中營養物質的比例來提高肥力。

通過相關性分析發現，稻田底泥細菌數量與真菌數量存在低度的線性正相關，推測可能是稻田里微生物的生長與真菌的生長有一定的耦合關系，細菌的某些代謝產物可能被真菌利用，這個推測與Mackie等［17］的研究相符合。而細菌與放線菌、放線菌與真菌之間的相關性很小，但由于本研究是采用實驗室培養基法分析微生物種類，其種類不能完全反映底泥里的所有微生物種類，因此，細菌與放線菌、放線菌與真菌之間的相關性是否確實很小有待進一步研究。

系統聚類分析結果的3類與稻田的施肥處理類別的3類出現了一定的差異，可能與各稻田微生物基數大小和對施肥的反應存在一定的關系。分析稻田的微生物數量可以發現，1號稻田僅投喂飼料，雖其底泥微生物的基數很大，但后續由于沒有進行施肥，微生物的數量相比于其他施肥的稻田較少。8號稻田在施肥前，底泥中的真菌較多，而細菌和放線菌較少，但是施肥后，細菌生長迅速占據了主導地位，一定程度上限制了其他2種菌的生長。10號稻田的微生物基數最小，且通過微生物數量變化趨勢可以看出，每次施肥后，10號稻田微生物數量的增長相對于其他稻田有一定的延遲，且試驗后期也一直維持在較低水平，明顯低于其他施肥處理的稻田，這也與10號稻田微生物基數小有一定的關系。而11號、12號、13號3個稻田的微生物基數較大，對施肥和投喂飼料的反應也較快。9號稻田的微生物基量雖不大，但是對施肥的反應較好；分析認為可能是肥料中的微生物有利于改善9號稻田的微生態環境，能夠促進稻田中原有的有益微生物生長，幫助創造一個更適合微生物生長的環境。

3.2 稻田底泥微生物的種類鑒定與優勢種

通過分子生物學的方法鑒定出了厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的11種細菌以及子囊菌門（Ascomycota）的4種真菌，未能鑒定出放線菌。程瑩寅等［18］直接分析草魚養殖池塘底泥細菌的DNA，鑒定了變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）以及未知菌。Jangid等［19］通過高通量測序鑒定出不同耕作類型土壤中的細菌，發現變形桿菌的數量最多，占30.6%～43.2%，其次是酸桿菌，占17.1%～26.2%。這些研究證明，變形菌門和厚壁菌門的種類是土壤中常見的細菌，其中一些種類也在水產養殖生產中起到十分關鍵的作用。根據實驗室測定的螺螄測產數據可以發現，12號稻田的螺螄生長情況最好，其增產率為57.86%。而11號稻田螺螄的生長情況較差，并出現大量死亡。微生物培養結果表明，12號稻田芽孢桿菌的數量明顯處于優勢，可能是螺螄養殖稻田的有益優勢菌占比大的原因，而11號稻田里出現了表皮葡萄球菌，推測可能是螺螄的致病菌，或者其破壞了螺螄健康穩定的生長環境進而導致螺螄的死亡。因此，在實際生產中可以在生物肥中額外添加芽孢桿菌等有益菌類，通過施肥改善螺螄養殖稻田底泥微生物的群落結構，以達到螺螄養殖更高產的目的。有研究者將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為水質改良劑添加到池塘中，發現養殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮和硫化物的濃度有明顯的減少，水體的pH也出現了下降［20，21］。同時可以通過監測螺螄養殖有害菌的存在與生長情況而及時預防與控制螺螄養殖病害問題。

王繼偉等［22］研究甘肅小隴山日本落葉松人工林土壤優勢真菌時發現，青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillum）是該土壤的優勢真菌。本研究鑒定出的真菌都是曲霉屬的真菌，分析曲霉可能是土壤中較為常見的真菌，是優勢真菌之一，其對土壤腐殖質的形成具有推動作用，能夠增加土壤肥力，改善環棱螺生產環境［23］。因此本研究鑒定出的細菌以及真菌，可能對水產養殖中的水質和底質改良具有潛在的功能，隨著微生態制劑和生物肥的研究和發展，將本試驗鑒定出的菌種作為添加劑的一部分是一種可行的方案。

4 小結

施肥可以明顯提高螺螄養殖稻田底泥中微生物的數量，施肥后底泥中3類微生物的數量都是隨著時間的推移先迅速上升然后緩慢下降。施基肥和第一次追肥后微生物數量上升很快，且在第一次追肥后達到了最高值。分析鑒定了對螺螄生長可能有益的微生物種類如芽孢桿菌，為后續在螺螄養殖生產中可以通過施肥、添加微生物制劑等措施改善稻田底泥環境提供參考價值。