檸條堆肥與耕作深度對連作黃瓜土壤細菌群落組成與代謝功能的影響

張凱歌，蘭摯謙，付玉芳，王曉卓，張雪艷

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

檸條(Caragana microphylla)作為防風固沙、保持水土的功能作物被廣泛種植于我國西北地區，根據生長情況需要定期進行平茬，據統計僅寧夏全區每年產生超過80萬t檸條殘茬廢棄資源[1]。檸條殘茬堆肥化處理作為資源再利用的有效途徑越來越被人們廣泛關注。Zhang等[2]研究發現，檸條堆肥氮素和有機質含量高，在長期連作的黃瓜土壤中連續施用可顯著增加根際土壤碳礦化，促進黃瓜根系發育。但檸條堆肥的高效施用尚缺乏系統性的研究。

有機肥常以底肥方式施入農田，不合理的施用伴隨著對土層過度的侵擾。免耕作為一種保護性耕作方式，減少了對土壤團粒結構的破壞，促進了生態環境的穩定性[3]，但長期免耕會導致土壤固、液、氣失衡，需要深翻打破犁底層，協調土壤中的水、肥、氣、熱，以改善土壤環境，促進土壤微生物群落多樣性和穩定性[4–6]。耕作方式對農田土壤環境的影響在小麥、玉米、棉花等大田作物上多有研究[7]，而設施土壤上的研究較少。

因此，本研究以檸條堆肥與不同耕作深度配合，探討對土壤養分和微生物多樣性等關鍵指標的影響，以期為檸條殘茬廢棄資源高效再利用，及設施農田生態可持續發展提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗在寧夏園藝產業園4號日光溫室進行，土壤質地為粉壤土(含砂粒23.5%，粉砂52.8%和黏粒3.7%)，土壤速效氮、磷、鉀含量分別為10.92、38.52、49.95 mg/kg，有機質含量為12.83g/kg。該區域海拔 1110.14 m，位于東經 105°53′—106°36′，北緯 38°26′—38°48′之間，屬于中溫帶干旱氣候，平均溫度6.28℃～13.1℃，年降雨量為129～600 mm。本試驗于2018年2月至2020年1月連續進行了4茬，供試黃瓜品種為‘博美626’(天津德瑞特種業有限公司)。試驗以雞糞+翻耕15 cm為對照(CK)，施用檸條堆肥分別配合免耕(T0)、翻耕15 cm(T15)、翻耕 35 cm (T35)、翻耕 45 cm (T45)，共 5 個處理。檸條、玉米秸稈、羊糞以質量比1∶2∶6混合作為堆肥原料，碳氮比 25∶1，堆肥50 天后即為檸條堆肥。檸條堆肥的理化性狀為：容重0.25 g/cm3、總孔隙度 79.2%、全氮 29.70 g/kg、全磷 18.60 g/kg、全鉀18.60 g/kg、有機碳475 g/kg。雞糞全量氮、磷、鉀含量依次為30.80、13.40、2.32 g/kg，有機碳含量為312 g/kg。5個處理的氮素投入量相等，雞糞施用量為 22.5 t/hm2，檸條堆肥施用量為 23.2 t/hm2，連同磷酸二銨450 kg/hm2和復混肥(N∶P∶K=20∶20∶20) 450 kg/hm2，在黃瓜移栽前一次性配合耕作作底肥施用。黃瓜采用高畦栽培，雙行種植，株距33 cm，行距70 cm。為防止處理間水分橫向運移，小區之間用泡沫板進行隔離，泡沫板埋入深度為80 cm。每個小區面積9 m2，每個處理3次重復隨機排列，進行統一追肥和灌水。

1.2 土壤樣品的采集與分析

在第4個栽培茬的盛果期(定植后2.5個月)，采用5點取樣法在每個處理每個重復的栽培畦中部(避開溫室最北部和最南部)取0—20 cm土層樣品。采用四分法將混合的土壤裝入自封袋后用冰盒帶回實驗室，新鮮土壤中剔除石子等雜物后，土壤過2 mm篩后，保存于–80℃冰箱中，用于土壤微生物群落多樣性分析。另一部分土壤風干磨碎過1 mm篩后用于土壤養分含量的測定。

1.2.1 土壤養分 土壤pH采用電位計法(上海雷磁，PHS-3E)，EC值采用電導法(上海雷磁，DDS-307)，有機質含量采用重鉻酸鉀—硫酸氧化法；全氮含量采用H2SO4消化—半微量凱氏定氮法；速效氮含量采用K2SO4浸提—流動分析儀進行測定[8]。

1.2.2 微生物群落多樣性 采用Biolog-ECO技術，稱取相當于10 g烘干土于250 mL錐形瓶中，加入 90 mL 滅菌去離子水，震蕩 1 h (200 r/min，4℃)，靜置30 min后，取上清液用滅菌去離子水稀釋1000倍，吸取 150 μL加至 Biolog-ECO 板的微孔中，25℃下暗室培養，每24 h在590 nm下測定吸光值，以每孔平均顏色變化率 (average well color development，AWCD) 作為微生物活性的有效指數，其公式為：

式中，C為微平板含有31種碳源每孔讀數，R表示對照微孔讀數，n表示96孔板中碳源底物的種類。

1.2.3 土壤微生物DNA的提取及測序 微生物宏基因組測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。土壤樣品微生物總DNA利用快速提取試劑盒 (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)提取。利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組 DNA 質量，用超微量分光光度計 (NanoDrop 1000，USA) 測定提取的DNA 濃度。采用通用的正向引物 338F (5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCA-3′) 和反向引物 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對細菌 16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增。PCR擴增程序如下：初始變性 2 min (98℃)，變性 30 s (95℃)，退火 30 s (55℃)，延伸 45 s (72℃)，進行 27 個循環，然后穩定延伸 10 min (72℃)。用 2% 瓊脂糖凝膠電泳對 PCR 擴增產物進行檢測。對擴增產物切膠回收，用 QuantiFluorTM 熒光計進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，合格后采用Illumina Miseq 平臺 (Illumina, Inc., San Diego, CA,USA) 對DNA片段進行雙端(Paired-end)測序。利用Vsearch軟件對所有樣品序列進行去引物片段，在98%相似度水平對去重后的序列聚類后輸出分類操作單元 (operational taxonomic units，OTUs)，使用QIIME2在Greengenes數據庫進行比對得到 OTUs 的分類學信息，得出物種對應的基因豐度和分類學水平上各樣品中物種的豐度，從而構建相應分類學水平上的豐度譜，并計算Chao1豐富度估計量、Shannon多樣性指數和Simpson指數及Pielou’s 指數。

1.3 數據統計

使用 SPSS 24 軟件，進行單因素 ANOVA 分析；用Origin 2018制作相關圖表。利用qiime2云平臺 (https://view.qiime2.org/)進行 α 多樣性分析 (包括Chao1、Shhanno、Simpson 等指數)，使用 R 軟件對環境因子、細菌群落和功能、微生物碳代謝功能指標進行冗余分析 (RDA分析)。

2 結果與分析

2.1 不同處理對黃瓜產量的影響

4個檸條堆肥處理的黃瓜產量與CK無顯著差異，黃瓜產量隨耕作深度增加而下降，免耕和淺耕處理(T0和T15)的黃瓜產量顯著高于深翻(T45)處理(圖1)。

圖1 不同處理的黃瓜產量Fig. 1 Cucumber yield of different treatments

2.2 不同處理對土壤理化性質的影響

施肥和耕作深度的改變影響了土壤pH、EC值、碳氮比和速效氮含量(圖2)。檸條堆肥處理中土壤pH隨耕作深度增加而上升，T0、T15和CK處理差異不顯著；T0、T15和T35處理土壤EC值和速效氮含量顯著高于CK，而T45處理速效氮含量顯著低于CK處理。與CK相比，檸條堆肥配合免耕和淺耕顯著降低了土壤碳氮比，而T35和T45處理的碳氮比保持穩定。

圖2 不同處理下土壤pH、EC、碳氮比和速效氮含量Fig. 2 Soil pH, EC, C/N ratio and available nitrogen content under different treatments

2.3 不同處理對土壤細菌群落多樣性的影響

各處理 Good’s coverage 指數均大于 0.96，表明本研究測序深度滿足分析要求(表1)，檸條堆肥各處理的 Good’s coverage 指數均高于 CK。細菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數均隨耕作深度增加呈先上升后降低的趨勢，T35處理最高。除T0外，其他處理 Shannon、Simpson 和 Pielou’s 指數均高于 CK，且深翻處理均顯著高于T0 (P<0.05)，說明檸條堆肥施用和深翻處理均有利于農田微生物群落多樣性發展。

表1 不同處理土壤細菌群落豐富度、多樣性和均勻度指數Table 1 Soil bacteria species richness, diversity, and evenness index under different treatments

放線菌門(Actinobacteria，40.77%)、變形菌門(Proteobacteria，26.26%)、綠彎菌門 (Chloroflexi，10.50%)相對豐度大于10%，為各處理中土壤優勢菌門。放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度隨耕作深度的增加顯著下降，而變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度與放線菌門相反，T35處理的酸桿菌門(Acidobacteria)、桿菌屬菌門(Patescibacteria)、Rokubacteria門相對豐度最高；T15較CK顯著提升了變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、Deinococcus-Thermus門、桿菌屬菌門(Patescibacteria)的相對豐度度；T0處理土壤放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和Deinococcus-Thermus門的豐度顯著高于T15處理(分別提高26.38%、295.83%和52.29%，圖3a)。

圖3 不同處理土壤樣品細菌在門(a)、屬(b)水平上的物種分布組成Fig. 3 Composition of bacteria at the phylum (a) and genus (b) levels in the soil under different treatments

5個處理土壤中諾卡氏菌屬(Nocardioides)和暈輪放線菌屬(Haloactinopolyspora)占主導地位。T0和T45處理較CK顯著降低了諾卡氏菌屬(Nocardioides)的相對豐度，其他處理與CK無顯著差異；T0、T15、T35和T45處理較CK提高了暈輪放線菌屬(Haloactinopolyspora)和特呂珀菌屬(Truepera)的相對豐度，但顯著降低了鹽單胞菌(Halomonas)和新疆鹽坑微菌(Salinimicrobium)的相對豐度。

由圖4所示，在UPGMA聚類樹上，施用檸條堆肥的4個處理(T0、T15、T35與T45)為一個大類，施用雞糞的處理(CK)為另一個大類，表明有機肥種類是造成土壤細菌群落結構差異的主要因素；檸條堆肥處理中，免耕(T0)與其他3個耕作處理土壤細菌群落結構分屬不同亞類，耕作制度也是影響細菌群落結構的重要因素；翻耕深度的增加改變了菌群結構，T45和T35處理分為一個小類，表明細菌群落關系最相近，其次與T15處理為一個亞類，三者細菌群落較為相近；從聚類分析圖中發現，不同處理菌群與CK的距離隨著耕作深度的增加而增加，說明施肥類型和耕作深度交互作用造成細菌群落結構差異的增加。

圖4 不同處理UPGMA聚類分析圖Fig. 4 Graphics of UPGMA clustering analysis in different treatments

2.4 不同處理對微生物功能多樣性的影響

圖5顯示了細菌豐度前19位的KEGG基因代謝通路條目。這19條代謝通路按照功能可劃分為代謝、遺傳信息處理、環境信息處理和細胞進程4大類。代謝功能與土壤物質循環密切相關，其中氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、萜類和聚酮化合物代謝、其他氨基酸代謝、類脂化合物代謝相關的微生物相對豐度大小順序均為T35>T45>T15>T0>CK。

圖5 不同處理土壤細菌代謝通路Fig. 5 Bacterial metabolic pathways in the soil under different treatments

細菌碳代謝功能對土壤物質循環和作物生長至關重要，細菌群落對6大碳源的利用程度如圖6所示。6大碳源中，土壤微生物對多聚物利用程度最高，對羧酸類化合物利用程度次之，對碳水化合物的利用程度最低。雖然不同碳源的利用程度受耕作深度的影響不同，檸條堆肥各處理對6種碳源的利用總的看來均顯著高于雞糞處理(CK)。免耕處理(T0)對氨基酸、胺類化合物和芳香類化合物的利用率均高于翻耕處理，而翻耕處理對羧酸類化合物和多聚物的利用程度高于免耕。

圖6 不同處理下6大碳源的利用情況Fig. 6 The utilization of six carbon sources under different treatments

2.5 環境因子、細菌群落和功能、微生物碳代謝的冗余分析

施肥和耕作主要通過改變環境因子影響土壤微生物。環境因子、細菌群落、細菌功能和微生物碳代謝間的冗余分析(RDA分析)結果(圖7)顯示，pH、EC和速效氮對細菌群落結構和微生物群落碳代謝功能影響顯著(P<0.01)，豐度排在前9名的細菌也與土壤碳代謝緊密相關，前兩軸解釋的環境因子、細菌群落、細菌功能和微生物碳代謝總變異分別為58.24%、58.266%、43.671%和80.76%。綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞桿菌門、羧酸類化合物代謝和萜類化合物和聚酮化合物代謝與土壤pH呈顯著正相關，酸桿菌門、芽單胞桿菌門、其他氨基酸代謝、異生物素生物降解和代謝和能量代謝與土壤碳氮比呈正相關，EC值和速效氮含量有利于厚壁菌門豐度和氨基酸代謝的提升，綠彎菌門和芽單胞桿菌門與羧酸類化合物代謝呈顯著正相關，厚壁菌門和放線菌門與胺類化合物和芳香類化合物呈顯著正相關。

圖7 環境因子(a)、細菌群落組成(b)、細菌功能(c)及微生物碳代謝(d)之間的冗余分析Fig. 7 Redundancy analysis among environmental factors, bacterial community composition, bacterial function,and microbial carbon metabolism

3 討論

本研究發現與傳統雞糞相比，檸條堆肥的施用并未顯著降低黃瓜產量。糞肥的長期施用會造成土壤酸化，從而影響土壤養分循環及作物生長[9]。本研究發現檸條堆肥連續施用較傳統雞糞提高了土壤pH，這是因為檸條堆肥施用后向土壤中輸入了更多中堿性物質，提升了土壤的緩沖能力[10]。同時，結合深翻可調節土壤耕層結構和土壤碳氮比，降低氮循環效應，從而促進有機肥分解消耗質子來抑制土壤酸化[11–12]。耕作深度增加降低了速效氮的含量，可減少表層土壤養分的聚集，降低土壤次生鹽漬化的風險。

微生物群落多樣性是表征農田土壤微生物群落功能的發揮和土壤特征及功能的重要指標[13]。本研究發現在相同翻耕深度下檸條堆肥施用較傳統雞糞提高了土壤細菌群落的多樣性，說明檸條堆肥含有更豐富的營養物質，促進了土壤微生物的生長。路穎等[14]研究也發現，性質、質量和分解速率差異的不同類型有機物輸入到土壤中，會對土壤微生物群落多樣性產生顯著影響。有研究表明耕作方式也是影響微生物多樣性的重要因素[15]。本研究發現檸條堆肥各處理中，耕作處理(T15、T35和T45)較免耕處理(T0)均提高了土壤細菌豐富度、多樣性和均勻度指數，T35處理最高。

本研究發現各處理樣品中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門為土壤細菌群落的優勢菌門，這與賈遠航等[16]研究的結果一致，這說明不同土壤的微生物群落存在很多共性和一定的環境適應性。盡管如此，施肥和耕作對土壤微生物群落結構組成造成了一定的影響，肥料類型為主導因素。本研究中，放線菌門的相對豐度最大，被視為土壤碳氮循環主要功能細菌[17]。有研究表明，放線菌門的相對豐度與土壤團粒結構的大小呈負相關[18]。相同耕作深度下，檸條堆肥處理放線菌門的相對豐度低于雞糞處理，這可能與土壤結構的變化有關。檸條堆肥為土壤微生物的物質循環提供了原料、能源和良好的生存環境，產生的有機無機膠結物質促進了團粒結構的形成，從而降低了放線菌門的相對豐度。同時，在檸條堆肥各處理中，免耕處理(T0)放線菌門、厚壁菌門的相對豐度高于耕作處理(T15、T35和T45)，這可能是放線菌門和厚壁菌門作為富營養菌在有機營養輸入條件下更多地依賴于不穩定的碳源[19]，免耕處理為放線菌門和厚壁菌門提供了更為充足的營養，其他菌群受外源輸入養分影響較小。耕作深度的增加改善了土壤耕層結構，促進了變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞桿菌門的相對豐度的提升。

本研究對細菌功能預測發現，代謝為細菌群落的主要功能，檸條堆肥各處理主要代謝通路基因豐度均高于CK，T35處理對氨基酸、碳水化合物等物質的合成促進效果最好。細菌碳代謝功能對土壤物質循環和作物生長至關重要[20]。本研究中檸條堆肥各處理碳源利用程度均高于CK，這可能是檸條堆肥作為豆科植物殘茬堆肥富含有機質，為微生物的生長提供了充足的有效碳源。耕作深度也顯著影響了碳源的利用，微生物對氨基酸、胺類化合物、碳水化合物和芳香類化合物的利用程度隨著耕作深度的增加而降低，而深翻處理提高了羧酸類化合物和多聚物的利用。

施肥和耕作分別通過直接和間接方式影響微生物群落[21]；一方面可以直接為微生物創造適宜的生存環境，另一方面通過調控環境因子改變微生物群落。有研究表明，不同處理間細菌群落組成差異主要取決于土壤性質[22]。本研究發現土壤pH、EC和速效氮含量對土壤細菌群落組成、功能和碳源利用均有顯著的影響，其中pH是影響土壤群落結構的主要驅動因子[23–24]。綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞桿菌門與土壤pH呈顯著正相關，檸條堆肥施用和耕作深度增加通過提高土壤pH來促進這些菌群豐度的增加。細菌群落的變化和生物功能緊密相關[25–26]。本研究發現，前9豐度的細菌顯著影響了土壤碳代謝，綠彎菌門和芽單胞桿菌門與羧酸類化合物代謝呈顯著正相關，厚壁菌門和放線菌門與胺類化合物和芳香類化合物呈顯著正相關。變形菌門和厚壁菌門作為富營養菌，可能會受到EC和速效氮等養分指標的調控，從而影響相關功能的表達，此外，EC值過高對大多數菌群結構和功能發揮呈負向影響。

4 結論

檸條堆肥對黃瓜的增產效果與雞糞沒有顯著差異。檸條堆肥配合免耕可提升土壤EC值和速效氮含量，配合深翻(35 cm、45 cm)可顯著提高土壤碳氮比和土壤細菌群落多樣性。放線菌門、變形菌門、綠彎菌門為土壤細菌群落的優勢菌門，檸條堆肥能提高土壤優勢菌門相對豐度，T35和T45能夠顯著提高變形菌門和綠彎菌門相對豐度。同時，檸條堆肥各處理也有效提高了主要代謝通路相對豐度，有利于菌群功能發揮；相對雞糞，檸條堆肥有助于細菌碳代謝能力的提升，結合深翻進一步提高了對羧酸類化合物和多聚物的利用。RDA分析表明，環境因子、細菌群落和菌群功能間主要處在共生關系，pH是影響土壤群落結構的主要驅動因子，可通過檸條堆肥和適當深翻(T35)來維持良好土壤環境，作為調節土壤微生物群落、維持農田生態可持續發展的重要方式；同時，可通過優化有機肥使用量及有機無機配比研究進一步提高產量。