廣東省侵染美香占2號的稻瘟病菌致病性及無毒基因變異分析

汪文娟，蘇菁，陳深，楊健源，陳凱玲，馮愛卿，汪聰穎，封金奇，陳炳，朱小源

廣東省侵染美香占2號的稻瘟病菌致病性及無毒基因變異分析

汪文娟，蘇菁，陳深，楊健源，陳凱玲，馮愛卿，汪聰穎，封金奇，陳炳，朱小源

廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640

【】分析侵染廣東稻區優質品種美香占2號稻瘟病菌（）的致病性及無毒基因變異特征，為美香占2號在不同稻區的合理布局提供參考依據。利用9個抗稻瘟病單基因系，對稻瘟病菌單孢分離菌株進行致病性測定；并利用8個稻瘟病菌已克隆無毒基因的功能性分子標記對2013—2018年不同年份、不同稻區采集的稻瘟病菌單孢分離菌株的DNA進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，選取不同帶型和不同年份代表性菌株的相應無毒基因全長或CDS區域的PCR片段進行測序。測序結果與相應無毒基因的參考序列進行堿基序列的比較分析；并利用相應的水稻抗稻瘟病單基因系，對無毒基因不同變異類型的稻瘟病菌菌株進行致病性測定。根據稻瘟病菌兩種交配型MAT1-1和MAT1-2型分子標記，檢測侵染美香占2號的稻瘟病菌可能存在的交配型。致病性分析結果顯示，2013—2018年采集自美香占2號品種的52個稻瘟病菌菌株對其中的4個單基因系IRBL9-W（）、IRBLzt-T（）、NIL-e1（）和IRBLkh-K3（）均表現無毒；然而，侵染單基因系IRBLz-Fu（）、IRBLkp-K60（）和IRBLi-F5（）的有毒菌株頻率維持在57%以上，且侵染單基因系IRBLz-Fu（）的有毒菌株頻率在不同年份間呈現顯著性差異，表明美香占2號種植區田間稻瘟病菌群體中存在較高頻率的、和毒性菌株。根據8個已克隆無毒基因的功能性分子標記檢測，在52個供試菌株中均可檢測到無毒基因、和，但擴增不到、和，僅有4個菌株可檢測到無毒基因，有3個菌株可檢測到無毒基因。所測序7個菌株的編碼區序列和包含啟動子及編碼區的序列與其各自無毒基因的序列完全一致；所測序7個菌株的包含啟動子及編碼區的序列中，有4個菌株的序列與無毒基因序列完全一致，有3個菌株在編碼區存在CTTT連續4個堿基的插入。在來自廣東不同稻區美香占2號的分離菌株群體中，共發現了4種不同的無毒基因擴增模式（擴增預期大小的條帶、有轉座子Pot3插入的條帶、有轉座子Mg-SINE插入的條帶和無擴增條帶），共呈現5種不同的單倍型（AvrPib-AP1-1、AvrPib-AP1-2、avrPib-AP2、avrPib-AP3和avrPib-AP2+avrPib-AP3），AvrPib-AP1-1和AvrPib-AP1-2是無毒型，而avrPib-AP2和avrPib-AP3則在基因的啟動子區域分別存在Pot3或Mg-SINE的插入而呈現毒性型，在1個菌株中檢測到avrPib-AP2+avrPib-AP3雙單倍型。交配型分子標記分析結果表明，檢測的52個稻瘟病菌菌株均為MAT1-2交配型，其中有2個菌株GD18-009和GD18-185采集于廣東韶關稻區，同時可檢測到MAT1-1交配型，具有雙交配型。在廣東美香占2號品種上分離的稻瘟病菌普遍含有無毒基因、、和，的變異類型豐富多樣，該研究結果可為優質品種美香占2號的科學布局及其種植區域其他不同抗病基因型品種的合理選擇提供參考。

美香占2號；稻瘟病菌；無毒基因型；交配型

0 引言

【研究意義】水稻（）是世界上最重要的糧食作物之一，由子囊真菌稻瘟病菌（）引起的稻瘟病是全球水稻生產上最具毀滅性的病害，顯著降低了水稻產量和谷物質量[1-3]。盡管種植抗病品種是目前控制稻瘟病危害最經濟、高效與環保的策略[4-5]；但由抗瘟基因控制的抗病品種在推廣種植3—5年后，常由于在寄主強大的選擇壓下，稻瘟病菌無毒基因的易變導致新的毒性小種產生及優勢化而“喪失”抗瘟性，成為高度易感病的品種，引發稻瘟病的重新流行與暴發[6]。美香占2號是近年來華南食味品質優異、推廣面積最大的優質稻品種[7]。隨著該品種連續多年在生產上的大面積推廣種植，其抗瘟性逐漸下降[8]。探明廣東稻區侵染美香占2號的稻瘟病菌致病性、無毒基因類型及其變異情況，可為本稻區該品種的種植、抗病品種的輪換以及新抗病品種的選育提供科學依據?！厩叭搜芯窟M展】水稻和稻瘟病菌間的互作系統屬于典型的“基因對基因”系統[9]，只有在寄主植物中存在相應的抗病基因，而病原菌中又存在與之匹配的無毒基因時，寄主才表現出抗病性[10-11]?？共』蚝蜔o毒基因的共同進化和相互作用促進了基因與基因間特異性“軍備競賽”模式的形成，從而導致抗病基因和無毒基因變異的多樣性[12]。目前，水稻稻瘟病菌的無毒基因有9個被克隆[13-18]。有研究表明，水稻品種中抗病基因在田間是否有抗病功能，取決于其對應無毒基因在田間稻瘟病菌群體中的存在頻率，這為基于無毒基因的分子診斷推斷抗病基因的有效性提供了科學依據[19-21]。稻瘟病菌的無毒基因顯示快速進化的特征，包括存在/缺失多態性[22-23]，這使得稻瘟病菌能夠克服水稻品種的抗性，導致病害流行。鑒定田間稻瘟病菌遺傳變異的方法主要有rep-PCR[24-26]、擴增片段長度多態性[27]、無毒基因特異性標記[19,28]以及傳統的鑒別品種[29]和具有單個主效抗病基因的單基因系鑒別品種表型鑒定等[30-33]?！颈狙芯壳腥朦c】深入闡明源自優質水稻品種的稻瘟病菌小種變異特征，需要從病原菌致病型、無毒基因型變異及田間病原菌群體的交配型分析等方面開展研究?！緮M解決的關鍵問題】利用9個水稻抗稻瘟病單基因系和感病對照品種麗江新團黑谷，對2013—2018年采集自美香占2號品種的52個稻瘟病菌菌株進行致病性分析，根據8個已克隆無毒基因（、、、、、及）功能性分子標記的檢測，明確源自美香占2號品種的稻瘟病菌無毒基因或其等位基因的存在/缺失情況，并對擴增的無毒基因產物進行測序，比較分析測序菌株間無毒基因序列的變異特征；利用自然界中存在的稻瘟病菌兩種交配型開發的分子標記，分析在廣東不同稻作區采集自美香占2號品種稻瘟病菌的交配型。為廣東稻區優質抗瘟品種的合理布局與稻瘟病的有效控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌材料、繁殖及產孢

病原菌來源：2013—2018年從廣東不同稻區的常規稻品種美香占2號上采集穗頸瘟標樣，從中分離、純化稻瘟病菌菌株。

田間采集的穗頸瘟標樣，用0.5%的強氯精消毒2 min，隨后用無菌水清洗，置于滅菌的培養皿中保濕培養約3 d，利用孢子振落法進行病原菌株的單孢分離。共分離獲得稻瘟病菌單孢菌株52個（表1），所有菌株保存于廣東省農業科學院植物保護研究所。

表1 采自廣東的52 個稻瘟病菌菌株信息

菌株活化及產孢：將保存的菌株轉移至酵母固體培養基，25℃左右的生化培養箱中活化培養7 d以上；然后將菌絲體轉接到玉米培養基上繁殖，25℃左右培養13 d。用消毒過的無菌水洗去玉米粒表面的菌絲，將玉米粒置于消毒的搪瓷盤中（25 cm×19 cm×2 cm），上面覆蓋一層濕紗布，然后在日光燈下光照培養3—4 d，進行產孢。

1.2 致病性測定

植物材料：9個抗稻瘟病單基因系分別為IRBL9-W（）、IRBLzt-T（）、NIL-e1（）、IRBLkh-K3（）、IRBL1-CL（）、IRBLta2-Re（Pita）、IRBLz-Fu（）、IRBLkp-K60（）、IRBLi-F5（），其中NIL-e1是廣東省農業科學院植物保護研究所以麗江新團黑谷為背景，育成的含0的抗稻瘟病近等基因系[34]，其余單基因系由國際水稻研究所選育。感病對照為麗江新團黑谷（LTH）。

材料種植：將水稻種子催芽后穴播于30 cm×20 cm×5 cm規格的搪瓷盆里，每盆播12個材料，每個材料播種量約為10粒種子，設置3次重復。稻苗采取旱育栽培，長至1葉1心期用硫酸銨施肥，每盆施肥量為0.5 g，接種前共需施肥3次。待稻苗長至3.5—4葉齡時，進行人工噴霧接種。

接種及調查：用無菌水洗下玉米粒上的孢子，用兩層塑料細紗網隔去玉米殘渣，配成適量濃度的孢子液，一般將孢子液濃度調至1×105個/mL，進行人工噴霧接種。接種后置于遮光密閉的培養箱中暗培養，在25℃及相對濕度達95%以上的條件下保濕24 h，之后轉至玻璃溫室，在25—28℃下保濕培養至稻苗發病，接種7 d左右調查稻苗的整體發病情況。病級調查方法按照國際水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分級標準進行：0—3級為抗?。≧）；4—9級為感?。⊿）。

1.3 稻瘟病菌DNA的提取

將分離純化的稻瘟病菌單孢菌株在CM（完全培養基）固體培養基上活化培養，挑取適量菌絲塊接到CM液體培養基中，于28℃搖床，160 r/min振蕩培養3—5 d，收集菌絲體；用Omega公司的真菌DNA抽提試劑盒提取菌絲體的基因組DNA。

1.4 無毒基因分子標記和交配型檢測

引物設計：8個已克隆稻瘟病菌的無毒基因（、、、、、、和）中，和分子標記設計分別根據NCBI GenBank中（GenBank 登錄號：KM887844.1）和（Genbank登錄號：EU837058.1）序列，利用軟件 Primer Premier 5.0，設計覆蓋和啟動子和開放閱讀框的區域。其他6個無毒基因的特異引物參照Selisana等[19]開發的標記，交配型分析分子標記參照Olukayode等[20]。所有引物均在生工生物工程（上海）股份有限公司（廣州生工）合成，引物序列詳見表2。

無毒基因分子標記檢測：PCR反應總體積為20 μl，其中包括稻瘟病菌基因組DNA（20—30 ng·μl-1）1 μl；10×PCR Mixture 10 μl，正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μl，ddH2O 8 μl。PCR擴增程序：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58—60℃（根據不同引物而定）退火30 s，72℃延伸1 min/kb，共設置35次循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物于1%—1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

1.5 部分無毒基因序列測序分析

利用高保真酶KOD-Plus（東洋紡，日本）進行PCR擴增，并對PCR產物進行目的片段的純化，將純化的PCR產物送到生工生物工程（上海）股份有限公司（廣州生工）進行測序。采用Lasergene7.0軟件中的SeqMan （http://www.dnastar.com/）進行測序序列的多序列比對拼接；并采用DNAStar MegAlign Clustal V軟件對有差異的核苷酸序列進行比較分析。

2 結果

2.1 分離自美香占2號菌株對部分水稻抗稻瘟病單基因系的致病性

利用9個水稻抗稻瘟病單基因系和感病對照品種麗江新團黑谷，對2013—2018年采集自美香占2號品種的52個稻瘟病菌菌株進行了致病性分析，其中由于2014年采集菌株數較少，未進行結果統計。結果如表3所示，所測定的菌株對其中的4個單基因系IRBL9-W（）、IRBLzt-T（）、NIL-e1（）和IRBLkh-K3（）均表現無毒。2013—2018年間，侵染單基因系IRBL1-CL（）的有毒菌株頻率在不同年份間呈現極顯著性差異；侵染單基因系IRBLta2-Re（Pita）和IRBLz-Fu（）的有毒菌株頻率不同年份間均呈現顯著性差異；侵染單基因系IRBLkp-K60（）IRBLi-F5（）的有毒菌株頻率在不同年份間差異不顯著。上述結果表明，在美香占2號品種種植區，可能由于田間稻瘟病菌群體中存在較高頻率的和的毒性菌株，且在2013—2018年間，和avrPita的毒性菌株頻率的不斷累積，導致美香占2號品種的抗性有效性逐漸減弱。

表2 本研究中用于檢測無毒基因和交配型的引物

表3 2013—2018年采集的稻瘟病菌群體中對抗病單基因系有毒菌株頻率

星號表示參數值差異顯著 Theasterisk indicated the values of the parameter differed significantly。 *：＜0.05，df=4；**：0.0001＜＜0.05，df=4；***：＜0.0001，df=4

2.2 美香占2號分離菌株含有的無毒基因型

為了確定試驗菌株中8個已克隆無毒基因的單倍型，利用Selisana等[19]開發的6個無毒基因分子標記及本研究室設計開發的[21]和分子標記（表2），通過PCR擴增，對52個供試菌株進行無毒基因單倍型分析。部分菌株無毒基因的PCR擴增結果如圖1所示。在52個供試菌株中均能檢測到無毒基因和的基因片段；相反地，在任何菌株中都擴增不到、和。其中只有4個菌株GD13-452、GD14-295、GD18-009和GD18-185可檢測到無毒基因的基因片段；僅有3個菌株GD16-034、GD18-009和GD 18-185可檢測到無毒基因的基因片段。啟動子和CDS序列的擴增和測序結果發現，無毒基因在所檢測的52個菌株中，共發現了4種不同的擴增模式，分別為擴增預期大小的條帶（AP1）、有轉座子Pot3插入的條帶（AP2）、有轉座子Mg-SINE插入的條帶（AP3）和無擴增條帶（AP4）（圖2-a、2-b）。AP1表示與擴增參考序列的無毒菌株CHL42（Genbank登錄號：KM887844.1）大小一致的擴增子，AP2和AP3分別代表大約1.0和2.5 kb的擴增子，比無毒分離株的預期大小要大（圖2-b），AP4表示擴增無帶，完全缺失。在52個廣東稻區分離菌株中，分別有5、12、33、1和1個菌株可檢測到AP1、AP2、AP3、AP2+AP3和AP4型基因型，檢測頻率分別為9.62%、23.08%、63.46%、1.92%和1.92%。

對GD13-452、GD14-295、GD15-196、GD15-205、GD16-034、GD18-009和GD18-185共7個菌株進行、和相應無毒基因的全長或CDS區域PCR產物測序。結果表明，所測序7個菌株的編碼區序列和包含啟動子及編碼區的序列，與其各自無毒基因的序列完全一致（Genbank登錄號分別為KM004023.1和EU837058.1）；所測序的7個菌株的包含啟動子及編碼區的序列中，有4個菌株的序列與無毒基因序列完全一致（Genbank登錄號：AB498875.1），有3個菌株（GD14-295、GD15-196、GD15-205）在編碼區存在CTTT連續4個堿基的插入（結果未顯示）。

M：Marker，DL2000或DL500；1—16：部分試驗菌株的DNA Some DNA samples of test strains

a：引物MGG-AvrPibF2/R2檢測轉座子Pot3和 Mg-SINE在AvrPib（KM887844.1）中的插入The positions of the Pot3 and Mg-SINE transposon detected by the primer pair MGG-AvrPibF2/R2 within the AvrPib sequence (KM887844.1)；b：17 個測序稻瘟病菌菌株的基因型，1—3（1條可見帶型）、4（缺失）Genotyping of 17 sequenced M. oryzae strains. 1-3 (one fragment of variable size), 4 (absent)

2.3 分離自美香占2號稻瘟病菌中無毒基因AvrPib等位基因單倍型的序列多樣性

為了進一步分析分離自美香占2號品種的稻瘟病菌等位基因的遺傳多樣性及其變異情況，選擇含有不同單倍型的15個代表菌株，對其擴增產物進行序列分析。結果表明，4個測序的AP1型菌株鑒定出了兩種源自AP1的不同單倍型，分別稱為和，與的參考序列相比，型僅在啟動子區域的兩個位置存在序列差異，即是-216 bp處5′-C-3′的插入和-124 bp處5′-AAC-3′的插入，其中有一個菌株GD13-394屬于AvrPib-AP1-2型，除了上述兩個插入，在-269 bp處還存在5′-TAAC-3′的插入（圖3-a）。源自AP2的單倍型，被稱為，所測序的5個菌株中，分別在-266、-232、-228和-52 bp處存在Pot3轉座子的插入，該Pot3轉座子的序列與NCBI公開的序列（Genbank登錄號：U60989.1）具有100%的核苷酸序列同源性，其中一個菌株GD16-196在-269 bp處還檢測到5′-TAAC-3′的插入。與不同，來自AP3的單倍型，被稱為，在-71 bp的位置存在Mg-SINE轉座子的插入，該Mg-SINE轉座子的序列與NCBI公開的序列（Genbank登錄號：U35313.1）具有100%的核苷酸序列同源性；除了Mg-SINE轉座子插入之外，在啟動子區域的其他兩個位置也含有與單倍型相同的序列突變（圖3-a）。Pot3轉座子的側翼為靶位點重復（TSD）的兩個堿基對序列（5′-TA-3′），在兩個菌株中-269 bp檢測到的5′-TAAC-3′插入序列，可以假定是從Pot3轉座子的插入位置切除了Pot3的插入序列引起的（圖3-a）。上述結果表明，轉座子的插入或切除可能在田間分離菌株中呈動態的變化。

2.4 分離自美香占2號稻瘟病菌不同AvrPib等位基因單倍型的致病性及出現頻率

為了明確不同等位基因單倍型菌株對單基因系IRBLb-B（）的無毒/有毒性反應，選取上述15個測序代表菌株，進行單基因系IRBLb-B（）的苗期致病性測定。結果如圖3-b、表4所示，AvrPib-AP1分離菌株顯示出對IRBLb-B的無毒性反應，表明它們都能夠觸發介導的免疫反應。相反地，AvrPib-AP2和AvrPib-AP3分離菌株對IRBLb-B具有毒性反應，表明它們沒有觸發介導的免疫反應。因此，將這兩種單倍型重命名為avrPib-AP2和avrPib-AP3。進一步分析了15個菌株中這3種單倍型的出現頻率，發現AvrPib-AP1-1、AvrPib-AP1-2、avrPib-AP2、avrPib-AP3和avrPib-AP2+avrPib-AP3單倍型菌株的出現頻率分別為20.00%、6.67%、33.33%、33.33%和6.67%（表4）。

a：AvrPib等位基因變異特征Characterization of allelic variations at AvrPib。WT：野生型 Wild type (AvrPib-KM887844.1)；AP1-1：TAACGT插入 TAACGT insertion；AP1-2：TAAC 插入 TAAC insertion；AP2：Pot3插入 Pot3 insertion；AP3：Mg-SINE 插入 Mg-SINE insertion。b：具有不同AvrPib等位基因變異型菌株的表型The phenotype of strains with different AvrPib allelic variations

表4 15個代表菌株的AvrPib單倍型特征

a基因位置是基于參考序列的位置The positions were based on the reference sequence of(GenBank accession number: KM887844.1)

2.5 分離自美香占2號稻瘟病菌群體的交配型分析

為了分析不同年份在廣東省不同稻作區采集的美香占2號侵染菌株的交配型，對52個菌株利用自然界中存在的兩種稻瘟病菌交配型MAT1-1和MAT1-2開發的分子標記進行分析。結果表明，選擇的52個稻瘟病菌株均為MAT1-2交配型，其中有兩個菌株GD18-009和GD18-185同時可檢測到MAT1-1交配型，具有雙交配型，這兩個菌株在廣東省韶關稻區采集（部分菌株的檢測結果如圖4所示）。

M：Marker，DL2000；1—15：部分試驗菌株DNA some DNA samples of test strains

3 討論

3.1 無毒基因監測與品種布局

基于抗病單基因系對稻瘟病菌無毒基因進行監測，結合已克隆無毒基因的分子標記分析病原菌的無毒基因型，可有效地用于稻瘟病菌無毒基因的精準分析及對水稻品種有效抗病基因的科學推斷[32-33]。目前，水稻抗稻瘟病近等基因系和單基因系已成為稻瘟病菌致病性及無毒基因分析的主要鑒別品種[30,35]。本研究所選用的一套由9個抗病單基因系構成的稻瘟病菌單基因系鑒別品種，其對我國華南秈稻區稻瘟病菌的致病性有較強的鑒別力[36]。本研究的單基因系監測結果表明，所檢測的52個稻瘟病菌菌株對其中的4個單基因系IRBL9-W（）、IRBLzt-T（）、NIL-e1（）、IRBLkh-K3（）均無毒?；跓o毒基因分子標記的檢測表明，在52個稻瘟病菌菌株中均可檢測到、和-型無毒基因，上述抗稻瘟病單基因系的監測結果與無毒基因型分析的結果相一致。據報道，具有的6個不同等位基因（A、B、C、D、E和F型），主要突變類型是基因編碼區單堿基的突變引起氨基酸的變異，共存在5個氨基酸突變位點（46、47、48、67和78）[13]，-型可被抗病基因和所識別，-型可被抗病基因和識別，-型可被抗病基因所識別[37]。在2013—2018年間分離的52個稻瘟病菌菌株中，侵染單基因系IRBLkp-K60（）的有毒菌株頻率66.67%—88.89%，且不同年份間差異不顯著；然而，在所有的菌株中都可檢測到-基因片段，推斷所檢測的目的基因片段大多屬于型或型，該推斷需要進一步對-擴增片段進行測序驗證。

本研究的單基因系監測結果顯示，侵染單基因系IRBLz-Fu（）和IRBLi-F5（）的有毒菌株頻率分別維持在57%和72%以上，表明美香占2號種植區田間稻瘟病菌群體中對抗病基因和具有毒性的菌株存在頻率較高。在2013—2018年間，侵染單基因系IRBL1-CL（）和IRBLta2-Re（Pita）的有毒菌株頻率較低，在34.0%以下；基于無毒基因的分子標記檢測，在52個稻瘟病菌菌株中也檢測不到無毒基因。由于無毒基因、AvrPita和尚未被克隆，因此未進行相應無毒基因型的檢測。本研究利用抗瘟基因和基因簇分子標記、和基因特異性分子標記檢測等對美香占2號品種含有的抗病基因進行檢測，結果均未檢測到抗病基因、及、抗病基因簇的等位基因（結果未顯示），推測美香占2號品種可能含有其他未被克隆的抗病基因。

綜上所述，根據侵染美香占2號的稻瘟病菌菌株對水稻抗瘟單基因系和無毒基因分子標記的檢測結果，在美香占2號感病區域應避免種植含抗病基因、和的水稻品種，可輪換種植含、、或等抗病基因的水稻品種，該結論與本研究團隊前期對廣東部分稻區侵染美香占2號稻瘟病菌致病性分析的結果相一致[8]。

3.2 稻瘟病菌無毒基因變異機制

為了抑制或逃避寄主植物的識別，稻瘟病菌常通過無毒基因的突變包括點突變、在基因或啟動子區域插入轉座子以及部分或全部刪除無毒基因從而導致無毒基因的功能喪失[15,38]。這些無毒基因的突變機制與抗病基因-無毒基因間協同進化的歷史、無毒基因的適應度及其在病原菌基因組中的位置相關。據報道，無毒基因與等位基因間呈現競爭性的階梯型共進化模式[37]。Li 等[38]分析中國云南省稻瘟病菌群體發現，自然界正向選擇壓下共鑒定到5種新的變異單倍型。無毒基因的等位基因呈高度多樣化，包括編碼區的部分缺失或完全缺失、點突變、移碼突變，啟動子區的轉座子插入等[24]。

關于無毒基因的突變分析，Zhang等[16]報道，在中國分離株中發現了基因片段缺失、點突變、TE插入和完全缺失4種變異，所有這些變異均導致了中國5個不同稻區稻瘟病菌群體對抗病基因的無毒性功能喪失。Olukayode等[20]分析了菲律賓田間稻瘟病菌群體的基因序列變異，發現中的Pot3轉座子插入導致稻瘟病菌對含的水稻品種具有毒性，并在3個不同的基因組位置檢測到 Pot3插入，導致3個不同的單倍型。孟峰等[39]在黑龍江省稻瘟病菌中檢測出4種帶型（無帶、高帶、中高帶與低帶）和5種基因型，未檢測到雙帶型。Xiao等[40]在27個代表菌株組成的稻瘟病菌群體中，基于PCR擴增子的序列鑒定了9種AvrPib不同的單倍型，即AvrPib-H1至AvrPib-H9型，其中AvrPib-H1與AvrPib（Genbank登錄號：KM887844）相同，AvrPib-H2、AvrPib-H4和Avr-Pib-H9與Zhang等[16]報道的相同。然而，AvrPib-H3在+97位（Genbank登錄號：MN630588）包含從A到T的單核苷酸取代，而AvrPib-H5至AvrPib-H8分別在-56、-274、-65、-125 bp處包含一個Pot3插入。Wang等[21]研究發現，在廣東韶關新銀占單一品種種植區采集的稻瘟病菌群體中，共發現了無毒基因4種不同的單倍型（AvrPib-AP1 -1、AvrPib-AP1-2、avrPib-AP2和avrPib-AP3），分別在上游的-266和-87 bp處檢測到轉座子Pot3或Mg-SINE的插入。本研究分別在上游的-266、-232、-228和-52 bp檢測到轉座子Pot3插入，在-71 bp處檢測到轉座子Mg-SINE插入；檢測到的轉座子插入位置具有更豐富的多樣性，這可能與稻瘟病菌雖都采集自單一品種美香占2號，但卻從廣東省不同的稻區采集相關。本研究中，在廣東省不同稻區美香占2號分離菌株群體中共發現了無毒基因4種不同的擴增模式：擴增預期大小的條帶、有轉座子Pot3插入的條帶、有轉座子Mg-SINE插入的條帶和無擴增條帶，共呈現5種不同的單倍型（AvrPib-AP1-1、AvrPib-AP1-2、avrPib-AP2、avrPib-AP3和avrPib-AP2+avrPib-AP3），AvrPib-AP1-1和AvrPib-AP1-2是無毒型的，而avrPib-AP2和avrPib-AP3則在基因的啟動子區域分別存在Pot3或Mg-SINE的插入而呈現毒性型，在一個菌株中檢測到avrPib-AP2+avrPib-AP3雙單倍型。本研究與Wang等[21]的研究中均在啟動子區域的兩個相同的位置檢測到單個或者連續幾個堿基的插入（-216 bp處5′-C-3′的插入和-124 bp處5′-AAC-3′的插入），推斷這兩個位點的突變可能是個古老存在的突變位點，在抗病品種引入之前該兩個位點的突變已經存在，由于該位點的突變不引起稻瘟病菌無毒基因功能的改變，從而在進化過程中得以保留。

4 結論

美香占2號種植區田間稻瘟病菌群體中普遍含有無毒基因、、和，而不含無毒基因、和在美香占2號感病區域可輪換種植含、、或等抗病基因的水稻品種。在美香占2號分離菌株群體中，無毒基因的變異類型具有豐富的多樣性，共發現4種不同的擴增模式，顯示5種不同的單倍型。啟動子區域分別存在Pot3或Mg-SINE的插入是導致無毒性功能喪失的主要機制，且轉座子的插入或切除可能在本試驗菌株中呈動態變化。侵染美香占2號的稻瘟病菌在田間主要以無性繁殖為主，絕大部分菌株只檢測到MAT1-2型，交配型較單一，在廣東韶關稻區檢測到MAT1-1和MAT1-2雙交配型的菌株，表明廣東韶關稻區田間稻瘟病菌交配型較豐富，該稻區稻瘟病菌群體可能存在著豐富的遺傳多樣性。

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pathogenicity and Avirulence Genes Variation offrom a Rice Variety Meixiangzhan 2 in Guangdong Province

WANG WenJuan, SU Jing, Chen Shen, Yang JianYuan, CHEN KaiLing, FENG AiQing, Wang CongYing, Feng JinQi, Chen Bing, ZHU XiaoYuan

Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640

【】The objective of this study is to analyze the pathogenicity and variation patterns of avirulence genes (genes) genotype of, which was collected from a high-quality rice variety Meixiangzhan 2 widely cultivated in Guangdong, and to provide a reference for the rational layout of Meixiangzhan 2 in different rice ecological areas.【】The pathogenicity of single-spore strains was determined using 9monogenic differentials. The DNA of the single-sporestrains collected from Meixiangzhan 2 in different rice areas and in different years from 2013 to 2018 was subjected to PCR amplification using the functional markers of 8genes. The PCR products ofgenes with promotor sequences or CDS regions were analyzed by agarose gel electrophoresis and the PCR products of representative strains were sequenced, and their sequences were compared to correspondinggenes, respectively. The correspondingmonogenic differentials were used to determine the pathogenicity ofstrains with different mutation types of thegenes. According to two mating types MAT1-1 and MAT1-2 molecular markers of, the possible mating type ofstrains isolated from Meixiangzhan 2 was detected.【】The pathogenicity analysis with a set of monogenic differentials showed that 52 rice blast strains collected from Meixiangzhan 2 from 2013 to 2018 were avirulent to IRBL9-W (), IRBLzt-T (), NIL-e1 () and IRBLkh-K3 (). The tested strains showed high frequencies (＞57%) of virulence to IRBLz-Fu (), IRBLkp-K60 () and IRBLi-F5 (), and the frequency of virulence to IRBLz-Fu () showed significant differences in different years, suggesting that thepopulation in the field of Meixiangzhan 2 planted area had a higher frequency of virulent strains of,and.,andfragments were almost present in all tested strains, but none of,orwas amplified in any strain. Only 4 strains could amplify the fragment of, and only 3 strains could amplify the fragment of. Amplicon sequencing of the 7 strains revealed that the sequences ofandwere identical to those of the correspondinggenes. Of the 7 sequenced strains in, 4 strains were almost identical to each other, and 3 strains had a ‘CTTT’ in the coding region of.Four different amplification types of(expected size bands, bands with transposon Pot3 insertion, bands with transposon Mg-SINE insertion, and non-amplified bands) were detected by electrophoresis analysis and 5 different haplotypes (AvrPib-AP1-1, AvrPib-AP1-2, avrPib-AP2, avrPib-AP3 and avrPib-AP2+avrPib-AP3) were detected by sequencing PCR products. The genotypes AvrPib-AP1-1 and AvrPib-AP1-2 were avirulent, while avrPib-AP2 and avrPib-AP3 showing insertions of transposon Pot3 or Mg-SINE with different insertion sites were virulent. A double haplotype of avrPib-AP2+avrPib-AP3 was detected in one strain. The result of mating type analysis with molecular markers showed that all of 52 tested strains belonged to the mating type of MAT1-2, two strains (GD18-009 and GD18-185) from Shaoguan, Guangdong were also detected with MAT1-1 mating type, indicating that these two strains had dual mating types.【】Among the strains from the high-quality rice variety of Meixiangzhan 2 in Guangdong, thegenes of,,anddistribute widely. The variation types ofare abundant. The results of this study will provide useful information for the rational layout of Meixiangzhan 2 and the deployment of other rotation varieties with different genotypes of rice blast resistance.

Meixiangzhan 2;; genotype of avirulence gene; mating type

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.007

2021-11-01；

2021-12-20

國家重點研發計劃（2016YFD0300707）、廣東省自然科學基金（2020A1515011213）、廣東省農業科學院“優秀博士”人才引進項目（R2021YJ-YB3020）、廣東省農業科學院學科團隊建設項目（202116TD）、國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-01-35）、廣東省現代農業產業技術體系（2021KJ105）、廣州市科技計劃（202002030001）

汪文娟，E-mail：juanlook@163.com。通信作者朱小源，E-mail：zhuxy@gdppri.com

（責任編輯 岳梅）