自發性早產孕婦血清中子宮平滑肌功能相關miRNA的表達及生物學功能分析

唐 瑤 龔小會 劉海燕 顧蔚蓉 李笑天，2 彭 婷△

（1復旦大學附屬婦產科醫院產科 上海 200011；2上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室 上海 200011）

早產是指孕周不足37周的胎兒娩出。早產兒的器官發育不成熟，出生后近期及遠期的患病率和死亡率均顯著升高［1］。根據WHO的數據，全球每年約數百萬的新生兒死于早產相關并發癥，早產也是我國繼肺炎后低于5歲兒童死亡的最常見原因［1-2］。除外醫源性早產，自發性早產是早產的主要原因。但是其發病機制不清，缺乏及時有效的干預措施。

妊娠子宮由靜息至收縮表型轉化導致提前不可逆的產程發動是自發性早產的主要特征，而miRNA被認為是子宮平滑肌轉化過程中的重要調控分子［3-4］。在子宮平滑肌細胞中，miR-200家族分子調控轉錄因子ZEB1、ZEB2和STAT 5B，而miR-199a-3p/miR-214調控靶基因PTGS2，它們的互相作用與雌孕激素對產程的調控密切相關［5-6］。本課題組也發現一系列miRNA在自發性早產臨產的子宮平滑肌中表達失常，其中miR-212-3p與炎癥導致早產子宮平滑肌功能異常密切相關［4，7］。研究顯示，miRNA能夠通過旁分泌或外泌體分泌等方式至外周循環成為游離的miRNA，后者可以局部自我調控或者作用于其他部位靶基因，參與疾病局部或全身的進展。早產孕婦血液中的確存在一系列表達失常的游離miRNA，研究者們陸續發現自發性早產患者血清中與宮頸長度、妊娠時長、巨大兒以及胎兒性別等有關的循環miRNAs［8-10］。但是妊娠子宮作為自發性早產核心器官，血清中與子宮平滑肌相關的miRNAs探索卻沒有獲得關注［11］。

在我們前期發現的早產子宮平滑肌相關miRNAs中，miR-212-3p經驗證發現與妊娠子宮平滑肌炎癥應激有關，miR-26b-5p和miR-223-3p分別調控全身炎性反應的關鍵基因和炎癥小體NLRP3，存 在 參 與 早 產 的 理 論 基 礎［4，12-13］；miRNA-936和miR-4746-3p因在早產子宮平滑肌中表達豐度相對較高，有穩定合適的商業合成引物，檢測的重復性較好，因此被納入研究。最后，與雌孕激素調節產程密切相關的miR-199a-3p/miR-214家族也是有價值的研究靶點［6］。為了找到早產血清特異的miRNA分子，本課題擬從上述8個miRNAs著手，采用病例-對照研究，應用定制Real-time PCR法尋找自發性早產患者血清中表達失常的miRNA，并通過生物信息學工具預測和構建相關miRNA的作用網絡，以了解其可能的作用，為后續早產機制研究提供新的方向。

資料和方法

研究對象和標本采集采用病例-對照研究，收集2017年5月—2018年8月間復旦大學附屬婦產科醫院產檢和分娩孕婦的臨床資料和血清，包括自發性早產42例（病例組）和正常妊娠32例（對照組）。自發性早產的診斷標準同早產臨產：妊娠滿28周至不滿37周前出現的規律子宮收縮（每20 min 4次或每60 min內8次，間隔5～6 min，持續時間達30 s以上），伴隨宮口擴張≥2 cm。對照組為同期于我院產檢的未足月的孕晚期產檢正常妊娠產婦，無腹痛腹脹或陰道流液。兩組的排除標準包括：多胎妊娠，輔助生殖，妊娠合并子宮肌瘤，妊娠合并子宮畸形，胎盤植入，胎盤前置，胎兒畸形，生殖道感染、發熱以及內科（孕前糖尿病、血液系統或者免疫系統疾?。┗蛘咄饪坪喜Y（膽囊炎、闌尾炎或胰腺炎）?；颊呷虢M后即刻采集5 mL的外周靜脈血，早產組血樣均采集于患者診斷為自發性早產診斷時，且在患者診斷時（即入組時）均進行了感染指標檢測，包括生殖道病原學培養、血常規和CRP；非早產組招募自妊娠32～34周常規進行血檢的孕婦，入組時均進行了血常規檢驗。

全血樣本于常溫促凝管中靜置30 min，然后于低溫離心機1 900×g離心10 min，上清液吸出后分裝并保存于-80℃冰箱?；颊咭话闩R床資料的采集包括年齡、產孕次、BMI、是否有妊娠期合并癥，通過電子檔案采集了早產組和非早產組病人的血常規報告以及早產組病人的病原學培養和CRP報告；該研究需隨訪至分娩后，獲得的妊娠結局資料包括分娩孕周及新生兒體重及APGAR評分。本研究獲得了復旦大學附屬婦產科醫院倫理委員會的批準（批件號2017-15），所有患者均簽署書面知情同意書。

Real-time PCR檢驗根據試劑盒的步驟，取200μL的血清加入Trizol裂解液，并在其中加入3.5μL cel-mir-39-3p的工作液作為外參以監測miRNA提取和逆轉錄的效率，采用離心柱法提取血清中的總RNA，隨后進行cDNA合成，所有試劑盒采購自德國QIAGEN公司（貨號217184和218161）?；贏BI 7500 HT實驗平臺，采用miScript SYBR Real time PCR試劑盒（貨號218073）和定制化miScript miRNA PCR板（貨號331231），同時檢測血清中8條候選miRNA（包括

miR-199a-3p，miR-936，miR-4746-3p，miR-26b-5p，miR-214-3p，miR-214-5p，miR-212-3p和miR-223-3p），3條候選內參miRNA（包括miR-16-5p，let-7d-5p和RNU 6-6P）以及cel-mir-39-3p、陰性和陽性對照作為質控。定制化PCR板中的引物均來自QIAGEN已商品化的產品。PCR反應采用10μL反應體系，反應條件：95℃預變性15 min，然后94℃變性15 s、55℃退火30 s和70℃延伸30 s，共45個循環后反應結束，確認Real-time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR相對定量。目的基因miRNA的表達水平根據PCR擴增曲線所得CT值，CT值的閾值設置為40?；贜orm finder算法［14］，計算3條候選內參hsa-miR-16-5p，let-7d-5p和RNU6-6P的穩定系數，并選擇表達最為穩定的分子作為內參，比較內參基因與目的基因的CT值，得出各標本之間目的基因表達量的多少。計算公式：ΔCT=

生物信息學分析采用數據庫miRDB（mirdb.org）和miRTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）同時預測差異表達miRNA的靶基因，預測結果的交集作為差異表達miRNA的靶基因并納入后續分析。采用STRING（string-db.org）獲得靶基因互相關系后，基于MNC算法計算靶基因中的熱點基因，取排在前50位的熱點基因信息，導入Cytoscape軟件進行生物學通路的富集分析及熱點基因互作網絡圖構建［15］。

統計學方法采用SPSS 17.0軟件分析，連續性變量采用±s或中位數M（IQR）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用用χ2檢驗或Fisher精確概率法。連續性變量的相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。采用Benjamini-Hochberg法對多次組間比較的P值進行矯正，矯正后FDR＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

早產和非早產孕婦臨床資料比較研究共納入42位早產孕婦和32位非早產孕婦，一般情況及臨床特征見表1。兩組在入組年齡、初產婦比例、采樣孕周、體重指數、妊娠期高血壓疾病及妊娠期糖尿病方面無顯著差異。早產組全血白細胞數目（white blood cell，WBC）和中性粒細胞數目（neutrophils，N）均顯著高于非早產組（P均＜0.05，表1）。早產組中，5例感染指標C-反應蛋白（C-reaction protein，CRP）升高，測量值分別為10、10、32、34、42 mg/L（參考范圍＜10 mg/L，低于10 mg/L不回報數值）；7例生殖道病原體培養結果異常，產后回報為解脲支原體攜帶者（參考范圍：陰性）。

表1 研究對象的臨床特征和妊娠結局Tab 1 Clinical characteristicsand pregnancy outcomes of the studied population

非早產組中有3例患者于本機構外分娩，她們在本機構末次產前檢查時間均為孕37周后，電話隨訪后確定分娩結局，患者均否認新生兒不良結局。早產組胎兒的分娩體重顯著低于非早產組胎兒的出生體重（P＜0.001），兩組胎兒性別比例無顯著差異（P=0.33）。本研究中，早產組的3例患兒1 min Apgar評分7分，復蘇后出生5 min Apgar評分均恢復正常。非早產組的新生兒出生Apgar評分和5 min后Apgar評分均正常范圍內。

早產和非早產組的血清miRNA表達情況比較根據Normfinder算法，穩定值數值越小、分子表達越穩定。本研究中候選內參miR-16-5p、let-7d-5p和RNU 6-6P的穩定值分別為0.44、0.16和0.66，故以let-7d-5p為內參計算血清miRNA分子的相對表達量。表2展示了目標血清miRNAs的相對表達水平及組間比較，早產組孕婦血清miR-936和miR-26b-5p的相對表達量較非早產組的分子相對表達量顯著升高（FDR均為0.036）。

表2 早產組和非早產組血清miRNA相對表達情況及比較Tab 2 Comparison of the relative expression levels of circulated miRNAs in NPand PTL groups

不同白細胞水平早產和非早產組的血清miRNA表達情況比較妊娠期WBC無公認的參考范圍，因此基于ROC受試者曲線取約登指數最大處的WBC值作為截斷值（即WBC=10.55×109/L），將所有人再次分為WBC升高組和WBC正常組（表3）。WBC升高組的23人中僅包括了4例非早產人群。WBC正常組共51人，早產和非早產人群比例相當。WBC升高組中，miR-936和miR-26b-5p在早產中雖表現出升高趨勢但不顯著。在WBC正常組中，miR-26b-5p和miR-936在早產人群中均顯著升高（P均＜0.05）。

表3 以WBC水平分層后早產組和非早產組血清miRNA相對表達情況及比較Tab 3 Comparison of the relative expression levels of circulated miRNAs in NPand NLPgroups after stratified with WBC level

N和WBC的測量值互相呈顯著強的正相關（Pearson相關系數0.929，P＜0.001），根據N進行分層分析可以得到相似的分層統計結果。在早產人群中再根據CRP升高與否、WBC升高與否以及攜帶支原體與否分別進行亞組分析，miR-26b-5p和miR-936水平均無顯著變化（P均＞0.05）。

早產組中調控失常miRNA的生物信息分析共有266個基因同時被數據庫miRDB和miRTarBase預測到是miR-936或miR-26b-5p的靶基因。利用STRING數據庫獲得靶基因的互作關系，并最終獲得前50位關鍵基因（Hub genes），包括miR-936的靶基因MBNL 1、FGF 2和HIST 1H 2BK，以及miR-26b-5p的靶基因PTEN、EP300及EZH 2等?；蚋患治觯℅ene Enrichment Analysis）結果顯示，主要富集的靶向通路包括細胞周期調控、miRNA調控、磷脂酰肌醇3-激酶活性的正調節及心肌細胞調控等方向（圖1）。

圖1 前50位關鍵靶基因的基因富集分析和互相作用Fig 1 Gene enrichment analysis and gene interaction network of top 50 hub genes

討 論

妊娠子宮提前由靜息表型轉為收縮表型是自發性早產主要臨床特征，它是自發性早產疾病進展的核心器官。本研究首次從子宮平滑肌角度出發，測定了孕婦血清中子宮平滑肌相關miRNAs的表達，發現血清miR-936和miR-26b-5p在自發性早產中異常升高。本文也針對miR-936和miR-26b-5p有實驗室證據支持的靶基因中尋找關鍵基因進行功能富集和基因本位分析，初步了解了miR-936和miR-26b-5p可能的作用通路。

人類外周血單核細胞在感染大腸埃希菌或西氏菌屬后表達高水平的miR-26b-5p分子，miR-26b-5p調節了約20%與敗血癥死亡率顯著有關的關鍵基因［12，16］；miR-26b-5p也能夠調控炎癥因子COX2及其合成產物PGE2［17］。在免疫性疾病如銀屑病中，miR-26b-5p在皮下脂肪組織中顯著升高與免疫相關單核細胞、纖維細胞及血管內皮細胞中膽固醇代謝的調控密切相關［18］。綜上，miR-26b-5p是一個重要的炎癥和免疫調控分子。盡管如此，本研究數據提示血清miR-26b-5p與早產的關系獨立于炎癥。近期國際的臨床研究提示自發性早產中磷脂代謝異常，有趣的是，我們預測的miR-26b-5p關鍵靶點也富集于磷脂代謝調節過程，miR-26b-5p是否參與上述過程需要進一步實驗驗證［19］。

與本文報道的結果相反，Wang等［20］發現早產中miR-26b-5p異常降低，胎盤中miR-26b-5p下調是維生素D缺乏導致早產的重要調控分子。由于本文的研究對象為經濟和營養條件較好的國內一線城市患者，維生素D缺乏導致的早產并非主因，并且本研究聚焦于血清而非胎盤，不同的人群和樣本類型可能造成研究間的差異。

目前暫無研究提及miR-936在早產中的作用。miR-936靶向的FGF 2是本文預測靶基因作用網絡的熱點基因之一，可以調控心肌細胞的增殖及正性調控細胞內磷脂酰肌醇3-激酶活性等過程。本研究結果也提示，miR-936和miR-26b-5p還可能與機體的細胞周期調控和miRNA調控等功能有關。盡管如此，miR-26b-5p在組織和血清中的分子作用機制差異以及miR-26b-5p和miR-936在子宮平滑肌和外周器官的作用機制還需要進一步研究。

目前，受限于研究技術、分析方法及研究人群，早產血清中表達失控的miRNAs在不同研究間的異質性較強。甚至在2015年，Elovitz等［21］基于該課題組Array技術篩查結果認為早產患者血清miRNA與未早產者無明顯區別。但是后來其他科研團隊基于實時PCR和RNA測序等技術，陸續發現了與宮頸長度、妊娠時長、巨大兒以及胎兒性別等有關的循環miRNA［8，10，22］。同時，隨著RNA研究技術的不斷發展成熟，不限于循環中游離的miRNA這一形式，外泌體來源的miRNA、甚至環狀RNA都被證實在早產孕婦中呈現特異的表達譜［23-24］。因此，尋找早產血清中表達失控RNA分子仍是早產領域的研究熱點。

本課題探索了可能與早產有關的多種miRNAs在血清中的表達，采用穩定的Real-time PCR測定法及科學的血清miRNA內參篩選及鑒定法是課題的優勢之一。不足在于：本課題為小樣本的探索性研究，限制了差異性統計分析以及分層分析或亞組分析的把握度，需要在更大規模的人群中進行驗證；其次，由于缺乏正常分娩發動產婦作為參照，miR-936和miR-26b-5p與正常產程關系不能明確；最后，雖然通過生物信息方法預測了相關miRNA的功能，后續需要在體外實驗中證實miR-936和miR-26b-5p的功能及分子機制。

本研究結果顯示血清miR-936和miR-26b-5p水平在早產孕婦中顯著升高，并通過生物信息法初步了解了miR-936和miR-26b-5p可能的生物學作用，為早產發病機制的研究提供了新的方向。

作者貢獻聲明唐瑤 論文撰寫，實驗分析。龔小會 標本采集，實驗分析，論文修改。劉海燕標本采集。顧蔚蓉，李笑天 論文修改，數據審核。彭婷 實驗設計，論文修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。