腎細胞癌患者癌組織和血清微囊泡miR-378表達水平的臨床應用價值研究

張明威，陳 陽，王 靜，葛京平，張春妮，汪俊軍，王 成

（中國人民解放軍東部戰區總醫院a．檢驗科；b．泌尿外科，南京210002）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一種原發于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，其發病率居于泌尿系統惡性腫瘤第二位，死亡率居第一位，且仍呈現出明顯增長趨勢，防治形勢極為嚴峻[1]。RCC的發病機制尚不明確，臨床亦缺乏有價值的血清學標志物，因此，尋找和鑒定有價值的血清學標志物仍是診治亟需解決的重要臨床問題[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小分子核糖核酸，與多種惡性腫瘤包括RCC 密切相關，在腫瘤的發生、發展中扮演著“原癌基因”和“抑癌基因”的雙重角色。人外周血中也存在豐富、穩定表達的miRNA，RCC患者特定變化的miRNA 具備作為RCC 新型非侵入性分子標志物潛能。目前，已鑒定出多種在RCC患者外周血中顯著變化的miRNA。miR-378定位于人5 號染色體（5 號染色體:149,732,825-149,732,890），報道顯示其在RCC患者外周血中顯著變化，但不同研究結果呈現出明顯的不一致甚至相互矛盾，因此其變化趨勢及臨床價值仍有待進一步證實和探討[3-6]。近年來研究顯示，外周血循環miRNA 可包裹于細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），且EVs miRNA的檢測較循環miRNA 更具價值[7]，但目前RCC患者外周血EVs中miR-378的變化及臨床價值尚不清楚。同時，RCC 組織和EVs 中miR-378的表達變化或可為前期研究結果不一致提供新的線索。因此，本文針對RCC患者組織和外周血EVs 中miR-378的表達變化進行檢測和分析，并對其功能進行生物信息學分析，以期初步明確患者外周血及外周血EVs 中miR-378 變化、價值及潛在的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月～ 2018年12月在東部戰區總醫院泌尿外科初收并行腎癌根治術的RCC患者癌組織及對應的癌旁組織40 對，所有患者手術切除樣本均進行病理學確診并按照Furhman分級標準對腫瘤進行分級，其中Ⅰ級8 例、I～II級5 例、Ⅱ級16 例、II～III 級2 例、Ⅲ級3 例、Ⅳ級1 例及無法分級組織5 例；同時，收集RCC患者（男性32 例，女性28 例，年齡57.4 ± 12.8 歲）及年齡、性別匹配的健康對照（男性34 例，女性26 例，年齡59.6 ± 12.3 歲）血清標本各60 例，所有患者均經病理學確診，排除腎囊腫、腎良性腫瘤及其他腎臟疾病。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇（上?；瘜W試劑公司）；酸性酚（美國Sigma-Aldrich 公司）；3 mol/L（pH=5.5）醋酸鈉（美國Ambion公司）；miRNA 檢測探針及引物（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ExoQuick exosome 提取試劑盒ExoQuick-TC（美國SBI 公司）；DEPC 水（美國Sigma-Aldrich 公司）；PCR 試劑包括5 ×AMV buffer，10 mmol/LdNTP，AMV 逆轉錄酶，10 × PCR buffer,25mmol/L MgCl2，rTaq DNA 聚合酶（均購自大連TAKARA 公司）。5418 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；Tissuelyser-48全自動樣品自動研磨儀（上海凈信科技公司）；Nanodrop2000 超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；2720 型PCR 儀，7300 型實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystem 公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織RNA 提?。航M織標本離體30 min 內迅速冷凍于液氮，后置于-80 ℃保存，避免反復凍融。取黃豆粒大小組織放入1.5 ml 除酶Eppendorf 管中，然后加入1.0 ml Trizol 試劑，運用Tissuelyser-48 充分研磨后加入200 μl 氯仿，并按照Trizol 試劑說明書后續步驟提取組織RNA。RNA 溶于20μl DEPC水后用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定濃度，并調節濃度至0.5μg/μl 待用。

1.3.2 血清EV分離：RCC患者及對照血清標本用真空生化管采集空腹靜脈血3～5 ml，1 500 g 離心10 min 后取上清置于-80℃冰箱留存待用。血清EVs分離采用ExoQuick exosome 提取試劑盒并按照試劑盒操作說明書，從100 μl 血清中分離EVs后重懸于25μl DEPC 水中待用。

1.3.3 EVs RNA 提?。貉錏Vs RNA 提取采用課題組前期建立的酸性酚/氯仿一步法進行，提取的RNA 溶于20μl DEPC 水后保存于-80℃冰箱待用[6]。

1.3.4 miRNA水平檢測：組織和血清EVs miRNA水平檢測采用基于TaqMan 水解探針的RT-qPCR方法進行，miRNA 逆轉錄PCR，RT-qPCR 反應體系和PCR 參數設置參照課題組前期研究[6]。組織miRNA的水平測定以U6 為內參，表達水平以2-ΔΔCt方法進行計算，其中ΔCt=CtmiR-378-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁正常組織；血清EV miRNA的水平測定以miR-16 為內參，表達水平以2-ΔCt方法進行計算，其中ΔCt=CtmiR-378-CtmiR-16。

1.3.5 miRNA 靶基因及功能預測：miRNA 靶基因預測采用在線軟件TargetScan7.2，miRPathDB 2.0，TarBase 7.0和miRDB 進行，取四種軟件預測靶基因交集后進一步采用在線軟件Metascape分析miRNA 靶基因參與的生物學功能、調控通路和分子調控網絡。

1.4 統計學分析 數據統計、分析和繪圖采用Graphpad 8.0 軟件。正態分布數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布數據中位數（四分位數間距）[M(P25,P75)]表示，RCC 癌組織和對應的癌旁正常組織miRNA表達水平比較采用wilcoxon 配對秩和檢驗，RCC患者與健康對照血清EVs miRNA 組間比較采用M-U檢驗。運用ROC 曲線分析組織和血清EVs miRNA水平對于RCC的輔助診斷價值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RCC 組織中miR-378表達變化 qRT-PCR 測定結果顯示，40 例患者組織中，與對應的癌旁正常組織相比，miR-378的表達水平在31 例RCC 組織中呈現降低趨勢。miR-378 在RCC 癌組織中相對含量為0.050(0.016，0.137)，在癌旁正常組織為0.134(0.054,0.546)，兩組間比較差異有統計學意義（Z=-3.481，P=0.003）。

2.2 RCC患者血清EVs 中miR-378表達變化 qRTPCR 測定結果顯示，RCC患者血清EVs 中miR-378相對含量為8.295(4.930,15.60)，健康對照相對含量為3.501(2.005,6.853)，RCC患者EVs miR-378水平高于健康對照組，差異有統計學意義（U=850，P＜0.001）。

2.3 組織和血清EVs miR-378 診斷RCC的ROC曲線分析 見圖1。ROC 曲線分析結果顯示，組織和血清EVs miR-378 診斷RCC的ROC 曲線下面積分別為0.665（95% CI：0.544～0.786）和0.764（95%CI：0.680～0.848）。組織miR-378的最佳診斷臨界值為0.0714，敏感度和特異度分別為62.50%，67.50%；血清EVs miR-378的最佳診斷臨界值為5.137，敏感度和特異度分別為75.00%，65.00%。

圖1 RCC 癌組織和血清EV miR-378 診斷RCC的ROC 曲線

2.4 miR-378 靶基因及其調控通路生物信息學分析 見圖2。運用在線數據庫TargetScan7.2，miRPathDB 2.0，TarBase 7.0和miRDB 預測miR-378 可調控的靶基因數目分別為5 497，8 035，388和653 種，四種數據庫預測miR-378 共同靶基因為35 種（圖2A）。進一步通過Metascape 數據庫對35 種共同預測靶基因進行功能注釋和富集通路分析，結果顯示miR-378 靶基因主要與基因轉錄、分解代謝、細胞骨架蛋白調節和蛋白激酶活力調節等RCC 發生、發展密切相關的調控通路相關（圖2B）。

圖2 miR-378 生物信息學分析

3 討論

RCC 尚缺乏有價值的血清學分子診斷標志物，而循環miRNA 具備作為RCC 非侵入性血清學分子標志物潛能，其中循環miR-378 在RCC患者外周血中變化報道較多，但不同研究報道結果不一致，miR-378 作為RCC 新型分子標志物價值有待進一步探討。最新研究表明，血清EVs miRNA 可來源于病變組織或細胞主動分泌，其對于疾病診斷更具價值。本研究針對RCC患者外周血miR-378 變化報道不一致問題，通過對RCC 組織中miR-378的變化和臨床價值進行探討，并對血清EVs miR-378水平進行測定，發現miR-378 在RCC 組織中表達降低，而在血清EVs 中水平顯著升高，組織和血清EVs 中miR-378水平測定均可作為RCC 輔助診斷分子標志物，其中血清EVs miR-378的測定更具價值。生物信息學分析結果顯示，miR-378 可參與RCC 發生、發展密切相關的通路調控。

循環miR-378 具備成為RCC 診斷標志物的潛能，但不同報道結果不一致。REDOVA 等[3]和FEDORKO 等[4]研究組發現，miR-378 在RCC患者血清中水平顯著升高，可作為RCC 診斷分子標志物。HAUSER 等[5]則發現血清miR-378的水平在RCC患者和對照組之間無統計學差異。本課題組前期研究結果發現，miR-378 在早期RCC患者血清中水平顯著降低，是RCC 早期輔助診斷潛在的新型分子標志物[6]。報道顯示，腫瘤患者特定循環miRNA主要來源于腫瘤組織和細胞，對腫瘤組織miRNA表達測定可為上述不一致結果提供實驗依據[8]。本研究針對RCC 組織中測定結果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-378 在RCC 組織中表達水平明顯降低，與早期RCC患者血清中miR-378的變化一致。研究顯示，RCC 組織中miR-378的表達與腫瘤分期密切相關，早期（T1 期）RCC 組織中miR-378表達明顯低于癌旁正常組織，而中晚期（T2/T3）RCC組織中miR-378表達明顯高于癌旁正常組織[9]。結合課題組前期研究及本研究結果，我們推測RCC患者組織和血清中miR-378的表達與患者腫瘤分期密切相關，早期患者降低，中晚期患者升高，這可能是不同研究結果矛盾的潛在原因，也進一步提示組織和血清中降低的miR-378 可作為早期RCC患者輔助診斷分子標志物。

血清EVs miRNA 可來源于病變組織或細胞主動分泌，其水平變化可精準反映病變部位的動態病理變化，對于腫瘤的診斷較組織或循環miRNA 更具價值[10]。本研究針對RCC患者血清EVs miR-378的表達水平測定結果顯示，與RCC 組織中miR-378表達降低不同，RCC患者血清EVs miR-378表達水平升高，其對于RCC 診斷價值亦明顯優于RCC 組織miR-378 測定。本研究結果顯示，RCC患者組織和血清EVs 中miR-378 變化不一致，但具體分子機制不清楚。既往報道顯示，結腸癌患者miRNA 變化存在類似的現象。結腸癌患者癌組織中miR-200 家族顯著降低，而分泌的EVs 中miR-200 家族則顯示升高；分子機制研究顯示，蛋白激酶Cζ（protein kinase Cζ，PKCζ）和ADAR2 調控軸在癌組織和EVs 中miR-200 家族miRNA表達變化中發揮重要作用，癌組織中PKCζ表達缺失導致ADAR2 磷酸化水平降低，后者可促進腫瘤細胞miR-200 家族由胞內以EVs 形式釋放至胞外，導致結腸癌組織和細胞中miR-200 家族miRNA表達水平降低，而分泌的EVs 中miRNA水平升高[11]。因此，結合本研究結果，我們推測在RCC 組織和細胞中miR-378 也存在類似的分子調控機制，但是否由PKCζ/ADAR2 調控軸在此過程中發揮作用仍需后續深入研究。

本研究對于miR-378 生物學功能生物信息學分析結果顯示，miR-378 靶基因主要與基因轉錄、分解代謝、細胞骨架蛋白調節和蛋白激酶活力調節等腫瘤調控通路相關。研究顯示，miR-378的表達異常與食管鱗癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤密切相關，在腫瘤發生發展中扮演原癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。同時，大量研究顯示，miR-378 在分解代謝過程中也發揮重要調節作用。KULYTé 等[14]證實，miR-378可增強腫瘤惡液質患者脂解作用。SUN等[15]發現，miR-378 可通過調節膽汁酸合成影響膽固醇脂代謝。事實上，分解代謝特別是脂代謝異常又與RCC尤其是腎透明細胞癌的發生發展密切相關[16-17]。因此，推測RCC患者組織中miR-378的異常表達亦可通過對分解代謝的調節參與RCC的發生發展。另外，RCC患者血清EVs 中升高的miR-378 生理病理功能尚不清楚。相關報道顯示，血清EVs miR-378水平的升高與血管生成、腫瘤免疫逃逸密切相關，并可作為胃癌的潛在分子標志物[18]。NAN 等[19]發現，脂肪來源干細胞分泌攜載miR-378的EVs 可有效促進血管生成。BRIAND 等[20]發現，腫瘤細胞分泌的EVs miR-378 可抑制自然殺傷細胞（NK）顆粒酶B的分泌，降低NK 細胞對于腫瘤細胞殺傷毒性并導致化療情況下腫瘤細胞免疫逃逸，RCC患者血清EVs 中升高的miR-378 也可通過類似的作用機制發揮癌相關生物學功能參與RCC的發生發展。

本研究對于血清EVs miR-378 作為RCC患者輔助診斷標志物研究結果進一步表明，EVs miRNA是一類較組織miRNA 更具價值和臨床轉化應用潛能的分子標志物，具有操作方便快捷、能反復獲取、易于實時監控等優點[21]。但是，EVs miRNA研究仍面臨許多問題。首先，血清EVs分離尚無統一方法。目前應用較多的包括經典的超速離心法、密度梯度離心法、超濾法、試劑盒法、免疫法等，不同方法各具優劣勢[22]。本研究采用的試劑盒應用較為方便，適合單樣本血清水平操作，對于EVs miRNA 臨床轉化應用較具優勢，但分離的EVs 純度可能低于離心法和超濾法。范維肖等[23]通過比較不同EVs分離方法，發現超離法適合EVs 各方面研究，而膜親和層析法則更適合EVs 核酸研究，這對于后續EVs miRNA研究具有重要的指導作用。其次，EVs miRNA的測定無合適的內參。不同研究對于EVs miRNA的歸一化采用的方法各異，這對于EVs miRNA 臨床轉化應用和推廣造成了較大挑戰，亦提示EVs miRNA 合適內參及歸一化方法仍是未來研究的重要方向。

本研究存在一定的局限性。研究發現RCC 組織中miR-378的表達降低，推測其可能與PKCζ/ADAR2 調控軸作用相關，但具體分子機制仍需后續深入探討。其次，由于RCC miR-378的表達變化可能與患者臨床分期有關，但限于本研究樣本納入有限，且組織樣本臨床分期主要集中于早期RCC，是否不同分期樣本RCC miR-378表達存在統計學差異尚不確定。再次，本研究發現EVs miR-378的表達上調，但樣本量相對較少，且來自于同一醫院，EVs miR-378的RCC 診斷價值仍需多中心、大樣本量研究證實。另外，后續研究中應注重同一患者RCC 組織和血清EVs 中miR-378表達變化研究，對于明確miR-378 臨床價值具有較為重要意義。

綜上，本研究針對RCC患者血清中變化爭議較大的miR-378，對其在RCC 組織和血清EV 中的表達變化進行檢測和臨床價值分析，發現miR-378 在RCC 組織中降低，在血清EVs 中表達升高，RCC組織和血清EVs 中miR-378水平測定可作為RCC患者輔助診斷分子標志物；生物信息學分析結果表明miR-378 可通過調控基因轉錄、分解代謝、細胞骨架蛋白調節和蛋白激酶活力調節等腫瘤密切相關通路參與RCC 發生發展，通過對組織、血清EVs miR-378表達變化分子機制及功能研究可為RCC 診治提供新的思路和理論依據。