血清TLR-3，miR-181b及URBP聯合檢測在糖尿病腎病診斷及預后判斷的價值研究

祁椏楠，胡江偉，武 亮，高 倩，周雨聰，鄭慧霄

（邢臺醫學高等?？茖W校第二附屬醫院a.體檢中心;b.內分泌科;c.腎內科,河北邢臺 054000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見慢性并發癥之一，發生率約占2 型糖尿病總人數的30%～35%[1]，亦是導致終末期腎?。╡ndstage renal disease，ESRD）的首要原因[2-4]。因此，早期診斷DN 具有重要臨床價值。尿視黃醇結合蛋白（urinary retinol binding-protein，URBP）是反映腎近曲小管及腎功能早期損傷的較為理想指標。miR-181b 屬微RNA（microRNA，miR）的一種，前期研究已證實[5]，可靶向調控基質金屬蛋白酶抑制因子3，在功能上參與DN的發病機理。另有研究發現，DN 發生可能與Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）異常表達存在一定關聯性[6]，但關于TLR-3，miR-181b，URBP表達與DN 病情程度的關系及聯合診斷價值仍有待進一步驗證?；诖?，本研究檢測TLR-3，miR-181b，URBP表達，分析其對DN 患者的診斷價值及與預后的關聯性，旨在為臨床診治、預后評估提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月～2018年12月邢臺醫學高等?？茖W校第二附屬醫院收治的115 例DN 患者作為觀察組，另選取同期96 例2 型糖尿病作為對照組。其中觀察組：男性68 例，女性47例，年齡42～69 歲，平均50.97±3.62 歲；體質量52～76kg/m2，平均62.85±4.56kg/m2；糖尿病病程5.5～12.2年，平均9.26±1.28年。對照組：男性56例，女性40 例，年齡53～75 歲，平均63.11±4.92 歲；體質量52～76kg/m2，平均62.85±4.56kg/m2；糖尿病病程5.0～12.4年，平均8.99±1.35年。兩組基本資料（性別、年齡、體質量、糖尿病病程）均衡可比（P＞0.05）。本研究經我院醫學倫理委員會審批同意。

納入標準：1.觀察組均符合DN 診斷標準[7]，并符合以下標準：①6 個月內連續尿液檢查有2 次尿清蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）為20～200 μg/min，或30～300 mg/24 h；②尿沉渣異常；③腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）≤60 ml/（min·1.73m2）。2.對照組均符合2 型糖尿病相關標準[8]，且空腹血糖（fasting plasma glucos，FPG）≥7.0mmol/L 或口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）2 h 血糖≥11.1mmol/L。3.患者及家屬均簽署知情同意書。排除標準：①并發糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病足潰瘍等嚴重并發癥者；②原發性腎病者；③并發風濕性疾病、高血壓疾病或心血管疾病者；④既往有腎臟外傷或手術史者；⑤近期有免疫抑制劑或其他腎臟毒性藥物服用史者；⑥精神行為異常者。

1.2 儀器與試劑 ABI7900 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；BNP 特定蛋白分析儀（德國SIEMENS 公司）；速率免疫散射比濁法試劑盒（北京九強生物技術股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 URBP水平檢測：采集新鮮晨尿5 ml，采用BNP 特定蛋白分析儀以速率免疫散射比濁法檢測URBP水平。

1.3.2 血清TLR-3，miR-181b水平檢測：清晨空腹抽取肱靜脈血10 ml，4 500 r/min，離心10 min，分離取血清，檢測TLR-3，miR-181b 濃度，根據GenBank 數據庫，獲取2 個基因多態性位點序列，設計待測基因位點的聚合酶鏈反應（PCR）擴增引物及單堿基延伸引物，其中TLR-3 上游引物為5’-AGCCTTCAACGACTGATGCT-3’，下游引物為5’-TTTCCAGAGCCCTGCTAAGT-3’；miR-181b 上游引物為5’-GCGGATCATTCATTGCTGTCG-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3。根據20 μl 模板、50 μl 反應液構成PCR 反應體系，擴增條件：95℃ 5 min，93℃ 10 s，61℃ 30 s，反復循環40 次，61℃時采集熒光，以實時熒光定量PCR儀檢測TLR-3，miR-181b，并以2-△△Ct計算TLR-3，miR-181b 相對表達量。

1.3.3 腎臟病理損傷程度：采用腎小管萎縮與間質纖維化（IFTA）、間質炎癥、腎小球分級評分進行評估，其中IFTA 評分0分為無IFTA；1分為輕度，即病變程度＜25.0%；2分為中度，即病變程度25.0%～50.0%；3分為重度，即病變程度＞50.0%；間質炎癥評分0分為無，1分為與IFTA 相關的炎性浸潤，2分為無IFTA 區域也存在炎性浸潤；腎小球分級I 級為單純腎小球基底膜增厚，Ⅱ級為系膜基質增寬，Ⅲ級為結節性硬化，Ⅳ級為晚期糖尿病腎小球硬化。

1.4 統計學分析 采用SPSS19.0 統計學軟件分析數據，正態分布資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗；相關性采用Spearman 相關分析法；URBP及血清TLR-3，miR-181b 診斷價值評價采用敏感度、特異度表示，并以Med Calc 繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析單獨檢測和聯合檢測的診斷價值，以Hanley-McNeil 方法比較ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）。以α=0.05 為校驗水準。

2 結果

2.1 兩組TLR-3，miR-181b，URBP 檢測水平比較 觀察組URBP（4.12±1.24mg/L vs 2.88±0.86mg/L）及血清TLR-3（0.86±0.27 vs 0.59±0.18），miR-181b（2.55±0.76 vs 1.79±0.54）水平均高于對照組，差異有統計學意義（t=8.275,8.367,8.217,均P＜0.001）。

2.2 觀察組不同腎臟病理損傷程度TLR-3，miR-181b，URBP 檢測水平 見表1。觀察組不同腎臟病理損傷程度患者URBP及血清TLR-3，miR-181b水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 觀察組不同腎臟病理損傷程度TLR-3，miR-181b，URBP水平比較(±s)

表1 觀察組不同腎臟病理損傷程度TLR-3，miR-181b，URBP水平比較(±s)

腎臟病理損傷程度nTLR-3FPmiR-181bFPURBP（mg/L）FP間質炎癥（分）2321.10±0.33 24.213 ＜0.001 3.36±1.01 29.028 ＜0.001 5.45±1.64 31.789 ＜0.001 1500.85±0.262.47±0.744.05±1.22 0330.64±0.201.89±0.572.94±0.88 IFTA 評分（分）3291.09±0.32 15.375 ＜0.001 3.53±1.06 24.236 ＜0.001 5.69±1.71 23.905 ＜0.001 2400.88±0.262.52±0.754.06±1.22 1300.76±0.232.07±0.623.42±1.03 0160.58±0.171.75±0.532.74±0.82腎小球分級 Ⅳ241.05±0.31 13.906 ＜0.001 3.52±1.06 21.372 ＜0.001 5.98±1.80 27.603 ＜0.001Ⅲ450.93±0.282.64±0.804.18±1.25Ⅱ210.80±0.242.11±0.633.39±1.02Ⅰ250.60±0.181.83±0.552.84±0.85

2.3 腎臟病理損傷程度與TLR-3，miR-181b，URBP 相關性 見表2。Spearman 相關性分析結果顯示，DN 患者間質炎癥、IFTA 評分、腎小球分級與URBP及血清TLR-3，miR-181b水平呈正相關關系（均P＜0.05）。

表2 腎臟病理損傷程度與TLR-3，miR-181b，URBP 相關性

2.4 TLR-3，miR-181b，URBP 單獨及聯合診斷DN的ROC 曲線分析 見圖1。經URBP及血清TLR-3，miR-181b及三者聯合診斷DN的AUC分別為0.751，0.782，0.796和0.880，三者聯合診斷AUC 大于單獨診斷（P＜0.05）。

圖1 URBP及血清TLR-3，miR-181b單一及聯合診斷DN的ROC 曲線

2.5 TLR-3，miR-181b，URBP與遠期預后關系 見表3。隨訪12 個月，13 例DN 患者失訪，其中4 例電話號碼錯誤，4 例電話停機，5 例更換住址，剩余102 例共有35 例發展為ESRD，占比34.31%。根據ROC分析TLR-3，miR-181b，URBP 臨界值分組，當其＞0.64mg/L，＞2.40mg/L，＞3.7 mg/L為高表達，反之為低表達。URBP，miR-181b 高表達者ESRD發生率高于低表達者，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

表3 URBP及血清TLR-3，miR-181b與遠期預后關系[n（%）]

3 討論

腎臟活檢是既往臨床診斷DN的金標準，但其屬有創操作，臨床應用受到一定限制[9]。因此，探尋一種理想的DN 診斷標志物具有重要臨床價值。

miR-181b 參與機體生理、病理過程的調控過程[10-11]。本研究中，血清miR-181b 在DN 患者中過度表達，與王琳琳等[12]研究結果基本一致，并隨間質炎癥加重、腎小球分級及IFTA 評分增加而升高，這可能歸因于長期高糖狀態下，miR-181b表達顯著升高，可誘導體內蛋白質與血糖非酶結合，形成糖基化終末產物，產生過量自由基，進而加重腎小球血管內皮細胞損傷，破壞腎小球濾過屏障，導致持續性蛋白尿，從而造成細胞外基質大量堆積，加劇腎臟損傷程度，最終形成惡性循環。以上分析與結果說明miR-181b 參與DN的發生發展，可作為潛在分子生物學標志物。另外，本研究還發現，miR-181b 高表達可能增加DN 患者ESRD 發生風險，與王家芷等[13]觀點相似，說明高水平miR-181b 會影響DN 患者預后改善，早期檢測miR-181b水平有助于指導臨床評估預后。

TLR 信號是機體抵抗微生物感染的第一道防線，過度活化會導致炎性細胞浸潤，細胞及化學因子大量釋放，自身抗體產生[14]。本研究數據表明，TLR-3 高表達可能參與DN 病理進展。分析機制可能為TLR-3水平升高，可活化核轉錄因子信號通路，刺激CD80分子高表達，提高腎臟炎性反應，加重巨噬細胞浸潤，促進足突細胞融合，釋放大量蛋白尿水平，從而進一步提高DN 發生危險性。本研究還發現，血清TLR-3水平與DN 患者腎臟病理損傷程度有關。DN 發生可激活TLR3 信號通路，誘導腎小管上皮細胞釋放致炎因子，激活腎間質固有細胞，導致腎間質炎性細胞浸潤，細胞外基質大量堆積，介導腎臟病理損傷。提示以TLR-3 為靶點，抑制TLR-3表達，可能為預防DN 患者腎臟病理損傷提供新的策略。但TLR-3 高表達對DN 患者發生ESRD的影響小，可能與臨床尚未完全明確TLR-3在介導腎臟纖維化中的具體機制有關。

視黃醇結合蛋白（RBP）是血液中轉運視黃醇類物質的載體蛋白，在尿液中較為穩定[15]。曾福英等[16]報道指出，隨著DN分期進展，RBP水平呈升高趨勢，可作為DN 早期診斷的標志，支持本研究觀點。DN 發生時，腎小管上皮細胞分化，可引起細胞功能紊亂，加重腎小管炎癥損傷，破壞腎小球濾過功能，主要表現為URBP水平異常升高[17]。經Spearman 相關性分析還顯示，URBP與DN 患者間質炎癥、IFTA 評分、腎小球分級均存在正相關關系。充分說明URBP 有望成為評估DN 患者腎損傷的重要指標。機制在于，URBP水平升高會進一步破壞腎近曲小管重吸收功能，加重水鹽代謝紊亂，主要表現為尿液增多或水鈉潴留，從而加重腎臟病理損傷程度。另外，URBP 高表達會增加DN 患者ESRD 發生率，可能與腎小管細胞功能紊亂加重、脂聯素合成量減少有關。然而URBP 診斷DN的敏感度僅為56.52%，故本研究選擇聯合診斷，結果顯示，URBP及血清TLR-3，miR-181b 聯合診斷DN的AUC 為0.880，敏感度為72.17%，特異度為88.54%，提示三者聯合可能成為DN 診斷的潛在理想內源性標志物，為臨床提供治療新靶點。

綜上可知，URBP及血清TLR-3，miR-181b與DN 患者腎臟病理損傷程度有關，三者聯合可作為判定DN的生物學標志物，指導臨床防治ESRD。但本研究未研究URBP及血清TLR-3，miR-181b之間相互調控關系及可能作用機制，今后需擴大樣本量進一步研究，以期為DN 聯合靶向治療提供科學支持。