多發性骨髓瘤患者血清miR-1246和miR-4449的表達及臨床意義

于 艷，何 萌，楊 晶，王莉莉(涿州市醫院檢驗科，河北涿州 072750)

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是常見的惡性血液疾病，可造成骨損傷、腎臟病變及相關并發癥等，嚴重影響患者的預后及生活質量[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是近年來廣泛應用于臨床的一類非編碼RNA，參與調控MM的生物學過程，在MM的發病中起到極為關鍵的作用[2-3]。有研究發現，miR-1246及miR-4449 參與基因轉錄后水平表達調控，其表達失調在MM的發生、發展中起著重大的影響，有望成為MM 診斷和治療的潛在靶點[4-5]。然而，目前關于miR-1246及miR-4449 能否作為MM 診斷的生物標志物尚未清楚。本研究通過檢測MM 患者血清miR-1246及miR-4449表達水平，分析miR-1246及miR-4449 對MM的診斷價值，以期為MM的診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取涿州市醫院2017年1月～2020年10月收治的85 例MM 患者，男性52 例，女性33 例，年齡42～84（62.40±11.58）歲。依據MM的國際分期系統（International Staging System，ISS）[6]標準分為：I期17 例，II期27 例，III期41 例。按照MM 患者的診療情況分為初診68例和復發17 例。納入標準：①MM的診斷及療效評價參照《中國多發性骨髓瘤診治指南》[7]；②能配合研究。排除標準：①并發其他血液系統疾病及自身免疫性疾病者；②妊娠期、哺乳期。另選取體檢正常者50 例作為對照組，其中男性28 例、女性22 例，年齡45～72（60.52±9.70）歲。各組的年齡、性別等比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究與患者簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 ABI 7500 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），PCR 試劑相關試劑盒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。生化分析儀為貝克曼全自動生化分析儀。

1.3 方法 研究對象采集空腹靜脈血3 ml,3 500 r/min離心10 min分離血清，使用熒光定量PCR 儀檢測miR-1246及miR-4449。反應體系為20μl：1μl引物及探針Mix（20×），1.33 μl 反向轉錄脫氧核糖核酸，10μl TaqMan 通用混合物溶液（2×），7.67μl 雙蒸餾水。反應條件：95℃預變性 10 min，95℃變性15 s，60℃退火及延伸30 s，共45 個循環。另使用羅氏全自動生化分析儀檢測血清β2-微球蛋白（β2-MG）水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS20.0 統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。應用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平診斷MM的價值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MM 組和對照組血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平比較與對照組(0.42±0.07,0.73±0.16,1.85±0.64mg/L)比較，MM 組血清miR-1246（1.95±0.86），miR-4449（2.50±1.08）及β2-MG（6.30±2.42mg/L）水平均明顯升高，差異有統計學意義（t=13.348,14.365,12.910,均P＜0.001）。

2.2 MM 患者不同分期血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平比較 見表1。MM 患者III期血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平均明顯高于I期和II期（P＜0.001），II期血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平均明顯高于I期，差異均有統計學意義（均P＜0.001）。

表1 MM 患者不同分期血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平比較（±s）

表1 MM 患者不同分期血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平比較（±s）

項目I期（n=17）II期（n=27）III期（n=41） FP miR-12460.86±0.25 1.84±0.81 3.05±1.37 11.285 ＜0.001 miR-44491.07±0.34 2.28±1.05 3.96±1.87 13.846 ＜0.001 β2-MG（mg/L）3.52±1.05 5.40±1.61 9.37±4.10 10.508 ＜0.001

2.3 復發組和初診組血清miR-1246，miR-4449及β2-MG）水平比較 復發組血清miR-1246（2.61±1.13），miR-4449（3.18±1.64）及β2-MG（8.04±3.27mg/L）水平均明顯高于初診組（1.55±0.62，1.92±0.95，4.96±1.85mg/L），差異有統計學意義（t=10.217,12.116,8.530,均P＜0.001）。

2.4 miR-1246，miR-4449及β2-MG 單項及聯合檢測診斷MM的價值 見表2和圖1。血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平診斷MM的最佳截斷值分別為1.30，1.73和4.06 mg/L，三項聯合檢測診斷MM的曲線下面積[AUC（95%CI）]明顯高于miR-1246，miR-4449及β2-MG 單項檢測，其靈敏度和特異度分別為98.2%和85.0%。

圖1 miR-1246，miR-4449及β2-MG 單項及聯合檢測診斷MM的ROC 曲線

表2 miR-1246，miR-4449及β2-MG 單項及聯合檢測診斷MM的價值

3 討論

MM 是一種漿細胞異常增殖的惡性血液病，其發病機制與遺傳學的改變、細胞因子和骨髓微環境的相互作用以及原癌基因的活化等有關。多數的研究表明，miRNA 作為一類高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，在MM的發病過程中起到重要的作用，并可能作為MM 患者基因治療的新策略[8-9]。有研究指出，MM 患者細胞系和血漿中miRNA 顯著升高，miRNA 在MM 細胞中的下調抑制增殖，促進細胞凋亡，其通過直接靶向SOX6 在MM 進展中起著致癌作用，提示miRNA 可能是MM 防治的潛在治療靶點[10]。另有研究認為，miRNA 不僅具有顯著的腫瘤相關性和組織特異性，還具有良好的穩定性及易于檢測等優點，有望成為MM 早期診斷、療效監測、靶向基因治療的新型分子生物學標志物[11]。

本研究中血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平在MM 組均明顯高于對照組，提示miR-1246及miR-4449 在MM 中異常高表達，其可能通過發揮癌基因的作用來參與MM 發病。MANIER 等[12]研究指出，miRNA 能調控多種靶基因的生物學功能，miRNA表達譜及基因調控網絡與MM 發生機制密切相關，可能為MM 早期診斷、靶向治療和預后判斷提供幫助。本研究中隨著MM 患者ISS分期的增加，血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平逐漸升高，即III期＞II期＞I期，提示血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平升高與MM 患者的病情進展有關，可能參與MM的發生發展過程。吳曉穎等[13]研究發現，β2-MG水平在MM 患者Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期＞健康對照組，β2-MG水平升高與MM 患者疾病進展及預后相關，可為MM的臨床治療提供指導。LIU 等[14]研究表明，miRNA的高表達可能會促進MM 細胞的增值、轉移及耐藥，是評估腫瘤細胞增殖及遷移活力的重要輔助指標，為MM的診斷和治療提供了一個新的潛在分子靶點。本研中復發組血清miR-1246，miR-4449及β2-MG水平均明顯高于初診組，提示檢測血清miR-1246及miR-4449水平有助于了解MM 患者的復發情況。

應用ROC 曲線分析，發現miR-1246及miR-4449 單項指標診斷MM的AUC 均大于0.825，三項聯合診斷MM的AUC 最大，其靈敏度較高。說明miR-1246及miR-4449 可能是MM的生物學標志物，聯合β2-MG 檢測有助于提高MM的診斷效能。張煜等[15]研究顯示，血清miRNA表達水平診斷MM的曲線下面積為0.853，高于β2-MG，miRNA 可作為MM 診斷的非侵入性生物學指標，將其與β2-MG 聯合應用可提高MM的診斷效能，具有廣闊的應用前景。REN 等[16]研究發現，MM患者miR-1246的表達水平顯著增高，其高表達與無進展生存期縮短相關，miR-1246 在MM的發生發展中起促進作用，可作為MM的診斷、療效評價和預后指標，同時對了解患者個體化療行為及評價治療策略具有重要價值。另有研究表明，MM 患者血清miR-4449的相對表達水平顯著高于健康對照組，并與β2-MG水平顯著相關，血清miR-4449和β2-MG 聯合診斷MM的靈敏度高于單獨使用miR-4449 或β2-MG，提示miR-4449 在MM的輔助診斷中具有重要意義[17]。

綜上所述，血清miR-1246及miR-4449表達水平在MM 患者中明顯升高，且隨著MM 病情分期進展呈升高趨勢，miR-1246及miR-4449 聯合β2-MG 檢測有助于提高MM 診斷的靈敏度，可為MM的早期篩查提供幫助。但本研究樣本量較少，仍需更多的研究證實miR-1246及miR-4449 在MM中的臨床價值。