食管癌患者行根治性切除術后血清miR-216a和Bcl-2 mRNA表達水平及與預后的相關性研究

賈東輝，杜 宇，黃 飛，郝艷坤（保定市第二醫院胸外科，河北保定 071000）

食管癌(esophageal cancer)屬于世界范圍內常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來發現其發病率與死亡率呈日益增多趨勢，在全部惡性腫瘤死亡性回顧調查中僅次于胃癌，位居前列[1-2]。食管癌典型癥狀有進行性咽下困難、胸骨后疼痛等，如不及時采取治療，病情惡化至中晚期會并發呼吸系統感染等并發癥，甚至死亡[3]。隨著放療、化療等輔助治療方法的不斷發展，術后食管癌的總生存率有所提高，但整體治療效果仍然不夠理想[4]。因此，尋找可靠的預測指標對患者進行有效評估具有重要臨床意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是單鏈非編碼RNA分子，已有大量研究表明，miRNA在人類許多重大疾病的發生發展中均發揮重要調控作用[5]。微小RNA-216a（miR-216a）在多種腫瘤組織中異常表達，并表現出雙重性，即可下調發揮抑癌聚集作用，也可上調發揮癌基因作用，且有研究表明miR-216a與多種腫瘤預后情況相關[6-7]。B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因是抗細胞凋亡的重要基因，其過度表達可抑制其他凋亡因素，從而使癌細胞免受其他誘導劑誘發的細胞凋亡[8]。有研究發現[9]，Bcl-2 在食管癌患者血清中呈高表達，但其與食管癌患者根治性切除術后預后情況的關系少有研究。因此，本實驗探究了食管癌根治性切除術后患者血清miR-216a，Bcl-2 信使核糖核酸（mRNA）表達水平及二者與患者預后情況的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2012年10月～2016年5月于保定市第二醫院胸外科接受根治性切除術的食管癌患者152 例作為觀察組，其中男性106 例，女性46 例；年齡46～65（53.37±5.63）歲；＞60 歲20 例，≤60 歲132 例；TNM分期[10]：I～II期79 例，III～IV 期73 例；有淋巴結轉移75 例，無淋巴結轉移77 例。納入標準：①患者均符合《食管癌規范化診治指南(第2 版)》[11]中的診斷標準，且經病理學確診；②術前CT，超聲等檢查確認無遠處轉移；③術后生存時間在3 個月以上；④所有患者臨床資料完整，隨訪資料完整。排除標準：①并發其它惡性腫瘤患者；②術后病理學診斷為肺鱗癌患者；③不配合隨訪者。選取同期入院體檢的健康人85 例作為對照組，其中男性57 例，女性28 例，年齡46～63（52.28±4.95）歲。兩組受試者性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書,本研究經醫院倫理委員會審批。

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量PCR 儀（深圳市三莉科技有限公司，型號：MA-680）；Trizol試劑盒（上海聯碩生物科技有限公司，貨號：15596026）；逆轉錄試劑盒（賽默飛爾科技有限公司，貨號：K1622）；熒光定量PCR 試劑盒（上海谷研實業有限公司，貨號：GL1674）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與保存：抽取食管癌患者收治入院次日清晨空腹肘靜脈血（術前）與術后第1 天清晨空腹肘靜脈血（術后）以及對照組體檢時當日清晨空腹肘靜脈血各5 ml。血液樣本3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，保存于-80℃冰箱中備用。

1.3.2 實時熒光定量PCR 法檢測血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平：Trizol 法提取血清總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，將RNA 逆轉錄為cDNA，使用特異性引物和熒光定量PCR 試劑盒進行擴增，反應條件為：94℃預變性5 min，94℃ 30 s 變性，55℃ 30 s 退火，72℃ 90 s 延伸，共40 個循環。以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法檢測miR-216a，Bcl-2 mRNA的相對表達水平。引物由上海谷研實業有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 預后隨訪 術后隨訪5年，采用門診復查、電話隨訪等形式進行，隨訪起始日期為術后第1 天，隨訪截止日期為2021年5月31日，患者無失訪，根據隨訪結果將食管癌患者分為生存組49 例（隨訪5年內存活）和死亡組103 例（隨訪5年內死亡）。將隨訪5年內死亡定義為預后不良。

1.5 統計學分析 利用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）進行描述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間有差異進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料采用例數和百分比描述，兩組間比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier 生存曲線分析食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與患者5年總生存率的關系；多因素COX 回歸分析食管癌患者術后預后不良的危險因素；受試者工作特征（ROC）曲線分析術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平對食管癌患者術后預后不良的預測價值，并采用Z檢驗進行曲線下面積比較。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、觀察組術前和術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平比較 見表2。觀察組術前和術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（t=32.439,10.917,35.290,12.721,均P＜0.05），觀察組術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平顯著低于術前，差異均有統計學意義（t=25.411,26.648，均P＜0.05）。

表2 對照組、觀察組術前和術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平比較（±s）

表2 對照組、觀察組術前和術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平比較（±s）

項 目對照組（n=85）觀察組（n=152）F 值P 值術前術后miR-216a1.01±0.192.05±0.421.36±0.30304.5850.000 Bcl-2 mRNA0.68±0.151.54±0.330.99±0.21353.0800.000

2.2 食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與臨床病理特征的關系 見表3。食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與患者年齡、性別無關（t=1.014～1.812，均P＞0.05），與患者TNM分期、有無淋巴結轉移有關（t=4.622～10.944，均P＜0.05）。

表3 食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與臨床病理特征的關系（±s）

項 目nmiR-216at 值P 值Bcl-2 mRNAt 值P 值年齡（歲）＞60201.42±0.33 1.1290.261 1.02±0.24 1.0140.312≤601321.34±0.290.97±0.20性別 男1061.40±0.32 1.6810.095 1.03±0.23 1.8120.072女461.31±0.260.96±0.19 TNM分期 I～II期791.25±0.26 4.6220.000 0.84±0.19 8.0880.000 III～IV 期731.48±0.351.13±0.25淋巴結轉移 有751.57±0.39 8.2100.000 1.19±0.28 10.9440.000無771.14±0.240.78±0.17

2.3 生存組與死亡組術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平比較 死亡組術后血清miR-216a（1.50±0.34），Bcl-2 mRNA（1.09±0.25）表達水平高于生存組（1.06±0.21，0.77±0.16），差異均有統計學意義（t=8.326,8.190，均P=0.000）。

2.4 食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與患者5年總生存率的關系 見圖1。以術后血清miR-216a表達水平平均值（1.36）為界分為miR-216a 低表達組（miR-216a ＜1.36）79 例，其中40 例患者存活，39 例患者死亡；miR-216a 高表達組（miR-216a≥1.36）73例，其中9例患者存活，64 例患者死亡；miR-216a 低表達組患者5年總生存率50.63%（40/79）顯著高于miR-216a 高表達組12.33%（9/73），差異有統計學意義（χ2=25.483，P=0.000）；以術后血清Bcl-2 mRNA表達水平平均值（0.99）為界分為Bcl-2 mRNA 低表達組（Bcl-2 mRNA ＜0.99）77 例，其中35 例患者存活，42 例患者死亡；Bcl-2 mRNA 高表達組（Bcl-2 mRNA ≥0.99）75 例，其中14 例患者存活，61 例患者死亡；Bcl-2 mRNA 低表達組患者5年總生存率45.45%（35/77）顯著高于Bcl-2 mRNA 高表達組18.67%（14/75），差異有統計學意義（χ2=12.481，P=0.000）。

圖1 Kaplan-Meier 生存曲線分析食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與患者5年總生存率的關系

2.5 COX 回歸分析食管癌患者術后預后不良的危險因素 見表4。將差異有統計學意義（P＜0.05）的指標TNM分期、淋巴結轉移、miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平作為自變量進行多因素COX 回歸分析，結果顯示TNM分期III～IV 期、有淋巴結轉移、miR-216a，Bcl-2 mRNA 高表達均為影響食管癌患者術后預后不良的獨立危險因素（均P＜0.05）。

表4 影響食管癌患者術后預后不良因素的COX 回歸分析

2.6 術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平對食管癌患者術后預后不良的預測價值 見表5，圖2。血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平聯合預測食管癌患者術后預后不良的曲線下面積明顯高于二者單獨預測（Z=2.077，2.723，P=0.038，0.006）。

圖2 術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平預測食管癌患者術后預后不良的ROC 曲線

表5 術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平對食管癌患者術后預后不良的預測價值

3 討論

食管癌是目前全世界最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率呈逐年上升趨勢，有調查結果顯示，我國食管癌發病率占全球發病率的一半以上[12]。目前食管癌確切的發病原因還不明確，但目前認為影響食管癌發生的因素主要包括環境因素、生活習慣、遺傳因素等[13]。食管癌患者早期多表現為腹脹、食欲下降等癥狀，不具有典型性，極易被忽視，從而導致多數患者就診較晚，在采取手術切除治療后，因受到淋巴結清掃的局限性以及部分微小病灶較為隱蔽等影響，導致患者在術后仍會出現復發的情況[14]。

miR-216a 定位于人2p16.1 染色體，對其研究多集中于癌癥方面[15]。CUI 等[16]研究發現，miR-216a 高表達可提高卵巢癌細胞增殖率。WANG 等[17]研究發現，miR-216a 參與胰腺癌進展的調節，miR-216a 過表達可促進胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲。有研究顯示，miR-216a-5p 通過作用于Janus 激酶2（JAK2）基因抑制肝癌細胞增殖和侵襲，可作為潛在治療肝癌的靶點[18]。有研究表明，miR-216a 在胃癌患者腫瘤組織中呈低表達，在患者血漿中呈高表達，且血漿中miR-216a表達水平與手術預后相關[19]。另有研究報道，胃癌組織中miR-216a表達較癌旁正常組織高，miR-216a表達上調與胃癌的發生有關[20]。miR-216a 在食管癌中的研究較少，本實驗結果顯示，食管癌患者血清中miR-216a表達水平顯著高于健康者，且術前血清miR-216a表達水平顯著高于術后，提示miR-216a 參與了食管癌的發生。而生存組患者術后血清miR-216a表達水平顯著低于死亡組，提示miR-216a 可能參與了食管癌患者根治性切除術后的預后過程，與患者預后生存情況密切相關。

Bcl-2 家族是對細胞增殖、凋亡具有重要調控作用的一類基因，Bcl-2 基因是目前公認的參與細胞凋亡調控的重要基因之一，Bcl-2 基因表達異常增加可以使已有基因異常改變的細胞逃避凋亡，由此引發的基因異常事件的積累是導致細胞轉化和腫瘤形成的必要前提[21]。Bcl-2 基因可能是通過抑制線粒體膜上的通透性轉換孔，抑制細胞色素C和半胱氨酸蛋白酶-3的釋放，從而抑制細胞的凋亡[22]；通過抑制氧自由基的形成而抑制細胞死亡，此外，Bcl-2 還能通過改變細胞內細胞器的Ca2+內流而抑制凋亡[23]。有研究報道，非小細胞肺癌患者血清Bcl-2水平顯著高于健康對照者，且與患者不良預后相關[24]。在胃癌的研究中發現，胃癌組織中Bcl-2 蛋白表達高于癌旁組織，且Bcl-2 蛋白表達升高與幽門螺旋桿菌感染有關[25]。另有研究顯示，Bcl-2 可能與食管鱗癌分化不良有關[9]。而Bcl-2與食管癌患者預后情況的研究較少，本研究結果顯示，食管癌患者血清Bcl-2 mRNA表達水平顯著高于健康者，且術前血清Bcl-2 mRNA表達水平顯著高于術后，提示Bcl-2 mRNA與食管癌的發生有關。生存組患者術后血清Bcl-2 mRNA表達水平顯著低于死亡組，推測Bcl-2 mRNA 異常升高可能與食管癌患者預后死亡率升高有關。分析miR-216a，Bcl-2 mRNA與臨床病理參數的關系發現，食管癌患者術后血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平與TNM分期、有無淋巴結轉移有關，表明隨TNM分期的升高及淋巴結轉移的發生，miR-216a，Bcl-2 mRNA表達逐漸升高，提示miR-216a，Bcl-2 mRNA 參與了食管癌的發展過程。本研究發現血清miR-216a，Bcl-2 mRNA 高表達患者生存時間縮短，且TNM分期III～IV 期、有淋巴結轉移、miR-216a，Bcl-2 mRNA 高表達均為影響食管癌患者術后預后不良的獨立危險因素，推測血清miR-216a，Bcl-2 mRNA高表達可能與食管癌患者生存率降低有關，提示miR-216a，Bcl-2 mRNA 可能成為食管癌患者根治性切除術預后的潛在生物學指標。同時本研究顯示血清miR-216a，Bcl-2 mRNA表達水平聯合預測食管癌患者術后預后不良的曲線下面積較二者單獨預測高，提示聯合檢測血清miR-216a和Bcl-2 mRNA表達，可能對評估食管癌患者根治性切除術預后的幫助更大。

綜上所述，食管癌患者血清miR-216a和Bcl-2 mRNA 呈高表達，且二者與患者TNM分期、淋巴結轉移有關，是影響患者術后5年生存率的獨立預后因素，推測miR-216a，Bcl-2 mRNA 可作為評估食管癌患者根治性切除術后預后情況的生物標志物。本研究仍存在一定缺陷，僅從臨床角度探究了miR-216a，Bcl-2 mRNA與食管癌術后預后情況的關系，具體分子機制研究尚不深入，后續仍需要繼續進行深入研究，為食管癌預后提供新的參考。