支氣管擴張伴支氣管哮喘患者血清中micro RNA-146水平表達與肺功能相關性分析

韓雪嬌，劉紅紅，邢寧寧，李愛軍（邢臺市第三醫院呼吸科，河北邢臺 054000）

支氣管擴張和支氣管哮喘均屬于呼吸系統常見和多發性疾病，其中支氣管擴張是由于支氣管腔內大量中性粒細胞募集并產生組織炎性浸潤，主要表現為氣道出現反復難愈性感染以及氣道慢性炎癥反應，進而導致患者肺組織結構和功能受損[1]。哮喘是由多種細胞如T 淋巴細胞、肥大細胞、中性粒細胞和各種炎性介質以及細胞因子共同激發的機體慢性變態性反應，以氣道炎癥、高反應性以及氣道重塑為主要特征，患者常表現為氣流受限和呼吸困難[2]。哮喘一定程度上會導致支氣管擴張癥狀加重，兩者相互影響且相互促進病情發展，因此支氣管擴張并發支氣管哮喘患者往往表現出更嚴重的病情和癥狀，急性發作和加重更為頻繁，對臨床治療和病情管理造成重大挑戰[3]。目前支氣管擴張癥伴支氣管哮喘的發病機制尚未完全揭示，臨床診斷常需要結合支氣管舒張試驗以及高分辨胸部CT，導致存在的漏診率較高[4]。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是存在于人體內的一種非編碼單鏈RNA，長度約為20～25nt，miRNA 可參與和調控多種生理和病理生物學過程，且miRNA表達水平異常與多種疾病的發生發展密切相關，前期已有研究證實miR-155,miR-146 等多種miRNAs 可參與機體炎癥和免疫反應過程，但miR-146 家族是否參與支氣管擴張并發支氣管哮喘的發生發展機制尚且需要進一步研究證實[5]。本文以支氣管擴張并發支氣管哮喘作為研究對象，對比分析miR-146表達水平以及其對患者肺功能的影響和關系，進一步揭示miRNA 在支氣管擴張并發支氣管哮喘中的作用機制，并為臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取邢臺市第三醫院2017年1月～2020年8月期間收治的156 例支氣管擴張并發支氣管哮喘患者作為觀察組，其中，男性80例，女性76 例，平均年齡35.65±2.56 歲，體重55.02±3.22 kg。并以同期150 例健康體檢者作為對照組，其中男性68 例，女性82 例，平均年齡36.01±2.74 歲，體重54.78±3.18kg。兩組患者的性別、年齡、體重等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會批準。

診斷標準：所有患者均符合《成人支氣管擴張癥診治專家共識》（2012年）[6]以及中國哮喘防治指南（2020年）[7]。

納入標準：①所有患者年齡＞18 周歲；②近期3 個月內未接受相關藥物治療；③簽署知情同意書且配合研究。

排除標準：①嚴重呼吸功能不全者或曾患有呼吸功能衰竭進行機械通氣者；②近3 個月因呼吸系統疾病而接受治療者；③有嚴重精神疾病者、自身免疫、心血管或造血系統疾病以及嚴重心腎功能不全者；④入組前使用糖皮質激素或免疫抑制劑者。

1.2 儀器與試劑 肺功能檢測儀（德國耶格公司，型號：MasterScreen），酶聯免疫光譜分析儀（型號：FX-6MG），高速離心機（美國貝克曼庫爾特），實時熒光定量PCR 儀（賽默飛，型號：ProFlex），ELISA 試劑盒（默克公司），RNA 提取試劑盒（賽默飛），miRNA 逆轉錄試劑盒（Takara 公司）。

1.3 方法

1.3.1 肺功能測定：采用肺功能檢測儀對所有研究對象的相關肺功能指標進行測定，包括用力肺活量（forced vital capacity）,一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1），最大呼氣中期流量（maximal mid-expiratory flow，MMEF75/25 ）,最大呼氣峰值流速（peak expiratory flow，PEF）以及FEV1/FVC 比值。

1.3.2 血清炎癥因子表達水平測定：采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒檢測所有患者血清白細胞介素（interleukin）-4,干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）的表達水平。

1.3.3 血清miRNA-146 家族（miRNA-146a,miRNA-146b）表達水平測定：采取實時熒光定量PCR 法測定所有研究對象標本中的miRNA-146a,miRNA-146b表達水平。首先參照總RNA 提取試劑盒說明書使用方法對總RNA 進行提取，然后采用 miRNA專用逆轉錄試劑盒進行 miRNA 逆轉錄，miRNA-146a,miRNA-146b 以及內參U6 引物探針由上海閃晶分子生物有限公司提供，引物序列見表1。在37℃ 1h，85℃ 5min 反應條件下保溫一段時間后進行實時熒光定量 PCR。PCR 反應條件：95℃ 預變性20 s，95℃變性 5s，60℃ 35s，連續循環40 次[8]。

表1 引物序列

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件分析所有數據。其中計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗，相關性評估采用Pearson 相關性分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組肺功能指標比較 見表2。與對照組相比，觀察組患者肺功能指標（FVC,FEV1,FEV1/FVC,MMEF75/25,PEF）均明顯降低，差異有統計學意義（均P＜0.001）。

表2 兩組肺功能指標比較（±s）

項 目觀察組（n=156）對照組（n=150）tP FVC（L）2.68±0.843.34±0.926.558＜0.001 FEV1（L）1.65±0.232.03±0.2613.554 ＜0.001 FEV1/FVC（%）65.03±6.9682.67±7.14 21.884 ＜0.001 MMEF75/25（L/s）0.57±0.121.28±0.2333.658 ＜0.001 PEF（L/min）140.57±13.65 545.28±15.89 239.284 ＜0.001

2.2 兩組血清miR-146水平及血清炎癥因子水平比較 見表3。與對照組比較，觀察組患者血清miR-146a,miR-146b mRNA 相對表達量以及IL-4，INF-γ表達水平顯著升高，差異均具有統計學意義（均P＜0.001）。

表3 兩組血清miR-146水平以及血清炎癥因子水平比較（±s）

表3 兩組血清miR-146水平以及血清炎癥因子水平比較（±s）

項 目觀察組（n=156）對照組（n=150）tP miR-146a2.51±0.680.98±0.4123.939 ＜0.001 miR-146b1.68±0.491.01±0.3613.667 ＜0.001 IL-4（ng/L）325.41±32.78 228.69±26.15 28.587 ＜0.001 INF-γ（ng/L）232.12±18.48 202.25±17.36 14.56 ＜0.001

2.3 血清miR-146水平與肺功能指標相關性分析 見表4。 Pearson 相關性分析結果顯示支氣管擴張伴支氣管哮喘患者的血清miRNA-146a,miRNA-146b表達水平與FVC,FEV1,FEV1/FVC,MMEF75/25和PEF 等肺功能指標存在顯著負相關性，同時與炎癥因子IL-4,INF-γ表達水平存在顯著正相關性（P＜0.05）。

表4 血清miR-146水平與肺功能指標相關性分析

3 討論

支氣管哮喘主要是由遺傳和環境因素導致的支氣管慢性炎癥變態性反應疾病，患者主要臨床癥狀包括咳嗽、喘息、胸悶、氣促等，且常伴隨嚴重氣道高反應性，研究證實T 淋巴細胞、中性粒細胞以及氣道上皮細胞等多種細胞均參與支氣管哮喘的慢性變態反應發生過程。而支氣管擴張作為一種氣道慢性炎癥反應性疾病，CD4+，T 淋巴細胞、中性粒細胞以及巨噬細胞會在氣道內發生聚集和浸潤[8]。兩種疾病具有非常相似的潛在致病因素以及均對大環內脂類抗生素藥物具有較好的臨床反應，且T 淋巴細胞作為機體的重要免疫細胞，在兩種疾病的發生發展過程中均發揮重要參與作用，因此推測支氣管擴張與支氣管哮喘在免疫介導炎癥反應過程中可能存在類似的信號通路或發生機制，但目前關于支氣管擴張并發支氣管哮喘的確切致病原因以及病理作用機制尚未完全明確[9]。另外流行病學研究結果表明全球有3 億以上人口患支氣管哮喘，且在接受激素治療后并未得到完全有效緩解，特別是并發支氣管擴張疾病的哮喘患者的病情更加反復難愈，因此尋求該疾病的致病機制以及可能的治療靶點對于改善患者預后和生活質量具有重要臨床價值[10]。

肺功能作為哮喘發病嚴重程度的一種重要輔助診斷手段，其中FVC 可以有效判斷哮喘等氣道阻塞疾病患者的呼吸道阻力情況，一般健康人的FEV1/FVC 達80%以上，FEV1/FVC 值降低表明患者呼吸道阻力較大，哮喘病情較重。MMEF75/25是經FVC 曲線計算得出的用力肺活量處于25%～75%間的平均值，PEF 表示的是用力肺活量測定過程中的最快呼氣流量的瞬時流速[11]。以上肺功能指標可以綜合反映被測試者的氣道梗阻及呼吸肌功能情況。本文研究結果顯示觀察組患者肺功能指標（FVC,FEV1,FEV1/FVC,MMEF75/25,PEF）相比健康對照組明顯降低，與病情相對應。同時本文相關性分析結果表明患者肺功能與miR-146表達水平呈負相關，即肺功能越差，miR-146表達水平越高，這對于臨床上已經無法配合完成后肺功能檢查的急性支氣管哮喘或支氣管擴張并發支氣管哮喘患者，采用抽取外周靜脈血檢查血清miR-146表達水平以輔助診斷患者病情嚴重水平，以指導臨床干預治療和預后評估。之所以選擇miR-146 指標，是由于miRNA 是表達于人體內多種臟器的一種內源性RNA，具有調節機體細胞生長、分化以及凋亡作用，對于疾病發生和進展意義重大。隨著對miRNA 研究不斷深入，miRNA 在免疫炎癥性疾病如支氣管哮喘中的作用逐漸受到廣泛關注[12]。miR-146 是最先被發現存在于小鼠腎臟組織中的一類miRNA 家族，具有細胞纖維化以及炎癥信號通路抑制作用，后被證實高表達于人體的肺組織，特別是在哮喘患者肺部存在明顯異常表達，猜測其可能對哮喘的發病和病情進展起著重要調控作用[13]。miR-146a和miR-146b 均屬于miR-146 家族的兩個重要成員，其編碼基因分別位于5q34,10q24 染色體上，miR-146具有高度保守特征，miR-146a和miR-146b 僅在3’末端兩個核苷酸位點上存在些許差異，且兩者具有相同的種子區域和調控靶基因[14]。KUTTY 等[15]通過構建促炎癥細胞因子引發的人視網膜色素上皮細胞炎癥反應模型，發現miR-146a,mi-146b表達水平的上調分別對IL-1β以及IFN-γ產生極大依賴性，提示miR-146 家庭成員可能在免疫和炎癥反應過程發揮重要調節作用。Toll 樣受體（Toll-likereceptor，TRL）是參與人體非特異性免疫的一類重要蛋白分子，可通過激活NF-κB（nuclearfactor-κB，NFκB）信號通路以及該信號通路下游的多種炎性細胞和因子表達，誘發和產生炎癥瀑布級聯反應[16]。而miR-146a 啟動子區域可以與NF-κB 發生特異性結合，調控炎癥因子的轉錄和表達進而產生一條負反饋調節環路，對TRL相關信號通路產生阻斷效應，發揮下調炎癥因子表達作用[17]。HAN 等[18]研究結果證實哮喘患者氣道平滑肌細胞中miR-146及相關炎性因子表達水平顯著高于非哮喘者，進一步轉染研究結果發現，miR-146a 可以顯著調控和降低下游IL-1β,TNF-α 以及IFN-γ 等炎性因子的表達，而miR-146b 上述抑制作用較弱，提示哮喘患者肺組織中miR-146 特別是miR-146a表達水平的升高有助于進一步控制哮喘炎癥反應的發展。另外還有相關動物研究發現敲除小鼠體內的miR-146a 基因會導致B 細胞數量發生明顯下降，而miR-146a的過度表達又會導致小鼠發生自發性免疫紊亂淋巴細胞增殖綜合征，提示 miR146a 可能具有一定的B 細胞調節功能。同時哮喘小鼠體內的miR-146a，B 細胞表達水平明顯高于正常小鼠，說明miR-146a 可能與支氣管哮喘體液免疫存在重要聯系，推測miR-146 除了可以負性調節 TRL 信號通路抑制炎癥外，還可以通過作用于機體特異性免疫發揮抗炎作用[19]。本研究結果顯示，miR-146a和miR-146b與血清炎性因子IL-4和IFN-γ 呈正相關性，提示miR-146a和miR-146b的表達水平可以間接的提示支氣管擴張并發支氣管哮喘患者的病情程度。

綜上，miR-146 在支氣管擴并發支氣管哮喘患者血清中呈顯著高表達，且miR-146表達水平與患者肺功能存在明顯負相關性，miR-146 可能是通過負性調節 TRL 等相關炎性信號通路和作用于機體特異性免疫發揮炎癥抑制作用，但其在支氣管擴張伴支氣管哮喘中的具體作用機制仍需要進一步深入探究，為尋找新靶向治療藥物提供理論依據和支持。同時在日常臨床診治工作中，應注重對該類疾病發生并發重疊患者的鑒別和篩選。