轉座子介導MYB在果樹花青素合成中的調控作用*

江春陽，杜美娥，梁兆林，叢佩華，張利義

（1 中國農業科學院果樹研究所，農業農村部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧興城125100）（2 鄂爾多斯生態環境職業學院）

隨著社會經濟的發展和人們生活水平的不斷提高，消費者要求水果不僅要好吃，還要好看，而果實色澤是其顏值的重要表現，直接影響消費者選擇，因此，果實著色問題一直以來都是國內外研究熱點。果實著色主要歸因于花青素[1]，關于花青素相關的果實著色的分子機制已取得了重要進展[2-4]，本文重點就轉座子調控重要果樹果實著色的相關分子機制進展進行綜述，以期為研究果樹花青素代謝調控網絡和改善果實品質育種提供新的理論指導。

1 花青素的生理功能

花青素屬于水溶性黃酮類色素，通常都以糖苷形式存在液泡中，不同水果成熟時花青苷含量和種類不一樣，諸如影響蘋果和梨果皮的色苷主要為矢車菊素-3-O-半乳糖苷[4-6]，血橙和紅肉桃主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷[7-8]，葡萄主要為二甲花翠素-3-葡萄糖苷與二甲花翠素-3-乙酰葡萄糖苷[9]，藍莓主要為錦花葵素半乳糖苷[10]，草莓主要為天竺葵素3-葡萄糖苷[11]?；ㄇ嗨夭粌H賦予了眾多果實絢麗誘人的色彩、識別度以及成熟度[2]，而且在果樹生長發育過程中有著重要的生理功能，包括吸引昆蟲授粉，抵御紫外線、低溫、干旱及創傷等逆境脅迫[1-2]。此外，花青素具有較強的抗氧化功效，對人體有保健功能[11]。

2 MYB轉錄因子為調控果樹花青素生物合成的核心

植物花青素合成途徑是源自苯丙烷代謝的類黃酮合成途徑的一個分支，涉及多個結構基因、調控基因以及與其互作的環境因子[2-4]；其中，在果樹上通過復雜的調控網絡參與花青素的調控基因包括多種轉錄因子，如MYB、bHLH、WD40、BBX、WRKY、ERF、b-ZIP等[12]；而MYB轉錄因子的表達具有強烈的組織特異性，是花青素合成調控最核心的轉錄因子[1]。眾所周知，參與花青素代謝途徑上的任何一個基因突變都可能導致顏色表型變異；然而，從目前在多種果樹上全基因組或分離群體著色關聯分析可知，定位結果通常是MYB轉錄因子基因[11,13-17]。

MYB家族分4 個亞家族，包括1R-1MYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB，而R2R3-MYB又是花青素合成調控最重要的轉錄因子[3-4]。目前，基于完成測序的包括蘋果、梨、葡萄以及柑橘等重要果樹的基因組及其轉錄組信息，眾多R2R3-MYB轉錄激活因子和抑制因子被分離[3-4]；利用高質量的基因組分析發現，通常是結構上高度同源的MYB基因簇以串聯方式毗鄰排布在基因組上，諸如蘋果第9 號染色體上的MdMYB10和MdMYB90[18-19]與第17 號染色體上的MdMYB110a和MdMYB110b[19]、葡萄第2 號染色體上的VvMYBA1和VvMYBA2[20]以及柑橘第6 號染色體上的Ruby1和Ruby2[21]等。這些MYB基因簇通常與花青苷合成的能力息息相關，演化過程中2 個基因均受到不同程度的選擇；通常情況下，其中的1 個為主基因，而當發生芽變等事件后，2 個基因協同發揮作用[18]；有時這些MYB基因簇發生突變后，在不同種中演化出亞功能化調控機制[21]，使彩色表型更加多樣化。

3 轉座子介導MYB 模式調控果樹花青素

轉座子或稱轉座元件（TEs），是基因組中可移動的具有重復序列的遺傳元件，被喻為生命進化的種子。轉座子特征是其序列兩端含有相同或逆向互補序列，常占植物基因組很大份額，許多果樹的轉座子在整個基因組序列占比超過50%，如蘋果、櫻桃等果樹（表1）。

表1 幾種重要果樹的基因組大小及TE 所占百分比

轉座元件可以分成2 類，其中I 型轉座子又被稱為逆轉錄轉座子，是一類通過“復制—粘貼”機制來實現其在基因組中“跳躍”的轉座元件，其長末端重復逆轉錄轉座子LTR-RTs 是果樹中最為豐富的一類轉座元件，劃分為2 個大家族：Ty1/copialike 和Ty3/gypsy-like，LTR 通常具有5′-TG……CA-3′序列結構，靶點重復序列TSDs 4～6 bp[22-23]。II 型轉座子也叫DNA 轉座子，主要是通過“剪切—粘貼”的機制進行“跳躍”。2 類轉座子區別在于逆轉錄轉座子會通過RNA 逆轉錄自我復制，再逆轉錄成DNA 來完成轉座。

轉座子是果樹優異性狀的形成以及在應對逆境脅迫中不斷適應的遺傳基礎[33]。轉座子插入對鄰近基因的影響主要表現為插入突變、結構重排以及新調控元件和表觀修飾引入等[22-23]，這些影響可導致表型變異。其中，果實呈現絢麗多彩的表型，往往是具有多樣化調控色彩的轉座子之行為?；诋斍耙淹瓿傻墓麡浠蚪M，發現轉座子介導MYB基因調控花青素合成在果樹上較具普遍性，以下列舉一些經典的案例。

（1）蘋果。通過比較基因組，在果實著色的核心調控轉錄因子MdMYB1的啟動子上發現了一個redTE 逆轉座子插入，redTE 扮演了增強子角色，促進了MdMYB1基因在低溫和強光條件下特異表達，使果實著色；該發現詮釋了紅元帥和紅富士等品種成熟時為什么易著色，而金冠及王林等品種卻不易著色的疑問；不易著色的品種是由于缺少這一起增強功能的轉座子，MdMYB1表達有限，不能有效合成花青素的結果[24]。進一步通過電泳遷移率實驗證明響應低溫MdCBF2轉錄因子能夠結合到redTE 上，為我們理解低溫促進果實著色提供了新的洞察。有趣的是，redTE 自我重組形成了只保留一個LTR 的“solo-redTE”，solo-redTE 塑造了一種果皮顏色為橘紅色的新表型[34]，如嘎拉蘋果（圖版2）。

最近10 多年紅肉蘋果選育是一個重要的方向，在紅肉蘋果MdMYB10啟動子上游存在一個含6 個23 bp 的R6 重復序列（廣義上可視為轉座子），這個序列具有自激活及組成型表達特性，賦予了包括葉、果、花、枝干等整個植株為紅色的特性[35]。此外，還有一種II 型紅肉蘋果，葉片和植株是綠色的，而果肉是粉紅色的。根據逆轉錄轉座子的功能特點及其在植物基因和基因組進化中的作用，推測這種表型是由一個轉座子插入調控與MdMYB10高度同源的MdMYB110轉錄因子的結果[4,19]。

（2）葡萄。Kobayashi 等[36]2004 年在Science上發表論文表明，白色葡萄果實是由于VvMYBA1的啟動子區插入了Gret1 逆轉座子，導致該基因表達受阻，無法調控下游結構基因的表達，花青素無法合成，使果皮呈白色或綠色。Gret1 再次發生重組形成solo-LTR 使得VvMYBA1恢復了部分功能，使葡萄呈紅色表型[37]（圖版2）。

（3）柑橘。一個Copia LTR 逆轉座子Tcs1 插入MYB轉錄因子Ruby基因上游，為其提供了一個新的啟動子，使Ruby在低溫條件下誘導表達，使果肉呈現出顯著的紅色；在雜交過程中，Tcs1 發生了重組形成一個solo-LTR 使得后代Moro 的果肉顏色更深；更加有趣的是，中國血橙Jingxian 和意大利Tarocco 在它們Ruby基因上游分別發生了不同的轉座子插入事件，但有著相類似的表型效應，也說明這2 個品種有著不同起源史[38]（圖版2）。

（4）草莓。研究發現，結白色果實的二倍體野生草莓是由于FaMYB10轉錄因子中存在一個gypsy LTR 逆轉座子的插入，截斷了FaMYB10編碼，進而導致花青素苷合成受阻，因而發育為白色果實。而一個紅肉草莓突變體 FaEnSpm-2 是由于MYB10-2的啟動子區插入1 個CACAT-like DNA 轉座子，增強了MYB10的表達，促進了MYB10-2在草莓果肉中的表達和花色素苷的合成，導致了紅肉草莓的表型[11]（圖版2）。

（5）梨。已鑒定出PrMYB10（EU153575）和prMYB114（MF489219）是影響紅皮梨的2 個轉錄因子[15,39]。其中，Yao 等[15,40]以八月紅和碭山酥梨等雜交群體圖譜定位并功能驗證prMYB114是八月紅梨果實著色的關鍵基因，但沒有闡明prMYB114在群體中紅皮和非紅皮梨差異表達的原因。我們基于BartlettDH 基因組，在prMYB114轉錄因子ATG 上游1 299 bp 處發現插入了1 個LTR-RTs，該轉座子全長5 295 bp，LTR 為492 bp，TSDs 為TATAT。此外，在PrMYB10的起始密碼子ATG 上游1 654 bp發現插入1 個LTR-RTs，該轉座子全長3 938 bp，LTR 為526 bp，TSDs 為CATCT；在紅皮梨品種當中，八月紅和早紅考密斯是2 類不同著色類型，果色發育模式有所不同；其中，八月紅只有果實成熟時果皮才變紅，而早紅考密斯幼果期和果實發育期都是紅色。根據這些表型，我們推測和蘋果一樣是這些轉座子調控了紅皮梨的多樣化著色表型。Wang等[39]基于紅巴梨及其綠色芽變系，發現綠色芽變是由于PrMYB10啟動子區域發生甲基化導致的結果。已有研究表明，轉座子插入常常誘導周圍區域產生甲基化[41-43]，進而導致不同表型的出現。此外，梨上是否還有其他轉座子或重組solo-LTR 調控果實著色，值得進一步挖掘?？傊?，盡管以上這些發現仍需實驗驗證，但也為闡明紅色梨著色分子調控機制提供了新的線索。

以上這些案例，顯示有重復序列特性的轉座子插入MYB基因，扮演了增強子[24]、沉默子[37]以及啟動子[38]等多種功能角色，極大地拓展了我們以往對轉座子插入僅僅導致突變的簡單理解。因為當攜帶豐富調控元件的轉座子整合到基因組中并被重新用作宿主基因的調節者時，便開啟了全新的演化選擇；而轉座子之所以頻繁選擇核心的MYB轉錄因子基因作為靶標并非隨機，是因為在應對逆境時以這種調控方式可能更加靈活有效，進而TE-MYB控制花青素合成模式在演化過程中被大多數果樹所選擇。

4 問題與展望

芽變育種是果樹重要育種途徑之一，轉座子誘導表觀修飾或轉座是果樹發生芽變的一個重要原因[44]；果樹上存在豐富的芽變，特別是顏色變化，易于視覺識別，是發現和揭示轉座子功能較好的材料。目前，轉座子介導基因調控功能的重要性在果樹上仍然未得到全面探討。結合逆境條件下RNA-seq分析，我們發現逆轉座子如redTE 的LTR 區轉錄生成lncRNA（Long non-coding RNA），因為redTE 起增強子作用，常寫作eRNA（Enhancer RNA）。在蘋果著色方面研究表明，lncRNA 橋接了MdWRKY1和MdERF109轉錄因子，形成了MdWRKY1-lncRNA-MdERF109轉錄級聯模塊調控光誘導蘋果花青素生物合成[12]。那么諸如來源redTE 逆轉座子的非編碼作用機制又是什么呢？值得探討。

植物通過RdDM（RNA-directed DNA methylation）機制保證轉座子持續保持沉默，若轉座子發生轉錄，其會被降解生成siRNA；而siRNA 又反過來攜帶DNA 甲基化酶將發生表達的轉座子通過DNA 甲基化修飾使其沉默[22]。最新發現表觀遺傳標記修飾（mRNA 修飾是m5C 和m6A，DNA 為5mC 和6mA）在植物基因組上也普遍存在，且與基因表達、發育和脅迫響應有關[45]。最近在哺乳動物中發現了m6A調控染色質修飾水平與維持轉座子沉默狀態的新機制[46]，那么果樹上與著色相關的逆轉座子是否有類似的m6A 調控途徑和相似的功能？從RNA 甲基化的角度來認識轉座子的作用和調控將豐富果樹轉座生物學，是個有趣而富有挑戰的科學方向。

從蘋果、葡萄以及柑橘中可以看到，solo-LTR是由完整的LTR-RTs 通過同源重組而生成的，這類短的攜帶調控位點的solo-LTR 轉座子可能更容易被宿主所固定；因為當LTR-RTs 插入宿主基因組時，在帶給宿主新的序列資源信息的同時，也給其基因組創造了不穩定性的因素。而宿主先接受完整的逆轉座子插入，然后通過重組生成solo-LTR，這種趨利避害的進化策略完美地實現物種多樣性。此外，果樹上這3 個典型案例也間接說明solo-LTR 作為一種順式元件參與了基因的表達與調控，而且具有發育時期和組織器官特異性，今后需利用CRISPR/Cas9 技術直接驗證solo-LTR 調控果實著色的確切生物學功能。

總之，可以預見隨著測序與組裝基因組的成本大幅度的下降，更多個性化的果樹基因組序列將產生；通過比較基因組的方法，更多轉座子調控MYB基因的模式將在更多果樹上被發掘。從實踐而言，基于轉座子很容易開發出實用的分子標記[11,24]，為輔助育種家精準有效地培育具有理想果實顏色的新品種提供技術支撐。