毒胡蘿卜素誘導PC12 細胞凋亡的實驗研究

嚴 利，黃賽玉

（湘潭醫衛職業技術學院臨床學院，湖南 湘潭 411101）

凋亡（apoptosis）是缺血后神經元死亡的一種重要形式，凋亡信號途徑包括外源性途徑、內源性途徑和內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑[1，2]，其中前二者為經典凋亡途徑，ERS 為近年來發現的一種新的凋亡途徑[3]。毒胡蘿卜素（Thapsigargin，TG）是一種不可逆性內質網鈣離子ATP 酶抑制劑，可誘導內質網應激，而應激的持續存在將導致細胞凋亡[4]。目前，腦缺血后神經元凋亡的發生機制尚未明確，仍有待進一步研究。本研究主要探討毒胡蘿卜素誘導大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞的凋亡機制，以期為缺血后神經元凋亡的防治提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所；1640 培養基（Hyclone），胎牛血清和胰酶消化液（Gibco），青-鏈霉素溶液（碧云天），Thapsigargin 和MTT（Sigma），JNK3 和GM130（Proteintech），Caspase-3（CST），Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡（長沙維爾生物有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（Wellbio），HRP goat anti-mouse IgG（Proteintech），HRP goat anti-rabbit IgG（Proteintech），Super ECL Plus 超敏發光液（Thermo pierce），顯影液和定影液（WellBiology）。

1.2 細胞培養 PC12 細胞在含10%的胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養基中進行培養，培養裝置為5%CO2、37 ℃飽和濕度培養箱，隔天換液，取細胞形態良好、對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 藥物濃度及實驗分組 1 mg 裝的Thapsigargin 溶于1 ml DMSO 溶液中，儲液濃度為1 mg/ml。取1 μl加入到10 ml 完全培養基中，終濃度為0.1 μg/ml。PC12 細胞分別經正常情況下培養5 h（正常組）和加入濃度為0.1 μg/ml的Thapsigargin 處理5 h（Thapsigargin 組）進行以下實驗。

1.4 方法

1.4.1 MTT 法檢測 兩組設3 個復孔，處理5 h 后，每孔加入25 μl 溶解于DMEM的MTT 溶液（5 mg/ml），在培養箱中孵育4 h，棄掉培養液，加入150 μl DMSO 溶液，37 ℃搖床低速振蕩10 min，用酶標儀檢測細胞在490 nm 處的吸光度（A）值，計算出PC12 細胞的存活率。

1.4.2 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測 PC12 細胞凋亡率嚴格按照Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡試劑盒（貨號：KGA108）的說明書檢測PC12 細胞凋亡率。用不含EDTA的胰蛋白酶進行消化，以冰冷的PBS 洗滌2 次，離心（2000 rpm/min，5 min）后收集細胞，收集（1～5）×105細胞。除去上清液，滴入500 μl Binding buffer 懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI 使用液使其混勻，置于室溫下避光5～15 min 后，1 h 內采用流式細胞儀檢測其熒光強度。

1.4.3 Western blot 蛋白印跡法檢測 收集兩組PC12細胞，提取總蛋白，使用蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，按每孔上樣量50 μg 進行SDS-PAGE 電泳，恒流冰浴電轉至PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入相應一抗，抗JNK3（1∶500）、Caspase-3（1∶1000）和β-actin（1∶4000），4 ℃孵育過夜。用TBST 洗3 次，每次10 min。加入相應二抗37 ℃孵育1 h，TBST 漂洗4 次，ECL 顯影和采圖。β-actin 為內參，利用Quantity one 軟件將目標條帶與β-actin 條帶吸光度值之比調為其蛋白表達水平的相對值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 18.0 統計軟件對數據分析，計量資料以（）表示，比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PC12 細胞的形態觀察 PC12 細胞的形態呈圓形或錐形，貼壁不穩，易成團，胞間有突起相互連接，細胞折光性好，可見胞核，細胞狀態穩定后生長速度快，成簇生長，見圖1。

圖1 顯微鏡觀察正常培養條件下PC12 細胞的形態及結構（10×40）

2.2 Thapsigargin 對PC12 細胞存活率的影響 經0.1 μg/ml Thapsigargin 處理5 h的PC12 細胞存活率較正常培養的細胞明顯減少。Thapsigargin 組吸光度A 值為（0.1497±0.0357），低于正常組的（0.2573±0.0093），差異有統計學意義（t=5.0490，P=0.0070）。

2.3 Thapsigargin 對PC12 細胞凋亡率的影響 正常組PC12 細胞絕大部分均為雙陰性細胞，細胞結構完整，無明顯細胞凋亡或死亡，而經Thapsigargin 處理后PC12 細胞的凋亡率明顯增加，見圖2。Thapsigargin 組早期凋亡率及總凋亡率高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組PC12 細胞凋亡率比較（，%）

表1 兩組PC12 細胞凋亡率比較（，%）

圖2 AnnexinV-FITC/PI 法檢測PC12 細胞的凋亡率流式細胞分析圖

2.4 Thapsigargin 對PC12 細胞JNK3、Caspase-3 蛋白表達的影響 Thapsigargin 組JNK3、Caspase-3 蛋白表達高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組JNK3、Caspase-3 蛋白表達比較（）

表2 兩組JNK3、Caspase-3 蛋白表達比較（）

3 討論

隨著人口老齡化的加劇及卒中危險因素的不斷增多，腦卒中發病率逐年上升。腦卒中作為神經系統常見病、多發病，具有高復發率、高致死率、高致殘率的特點，目前已經成為全世界成人中第2 死亡原因和第1 致殘原因[5，6]，其存活者中有50%～70%的患者會遺留嚴重殘疾，給家庭和社會帶來巨大的壓力和沉重的經濟負擔[7]。卒中類型以缺血性卒中最常見，約占全部卒中類型的80%。腦缺血是由于血栓或栓子阻塞腦內動脈而導致血管閉塞，引起腦組織缺血缺氧、神經元受損的一系列臨床癥狀和體征[8]。缺血后神經元的凋亡發生是一種多環節調控過程，包括興奮氨基酸的釋放、鈣離子穩態失衡、熱休克蛋白表達受阻及血腦屏障破壞等過程[9，10]。內質網作為細胞凋亡途徑的調節器越來越受到重視。研究表明[11]，Thapsigargin 可抑制內質網鈣泵功能，誘導內質網中儲藏鈣的釋放，增加胞質中Ca2+濃度，導致Ca2+環境失衡，引起神經元凋亡。本研究中利用Thapsigargin誘導PC12 細胞，建立缺血后神經元損傷模型，通過MTT 法檢測存活率和Annexin V-FITC/PI 法檢測凋亡率，結果顯示Thapsigargin 組早期凋亡率及總凋亡率高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示經Thapsigargin 組處理后PC12 細胞的存活率較正常組明顯減少，凋亡率較正常組明顯增加。

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族中的重要成員，主要參與細胞存活與凋亡、增殖與分化等多個生物學過程。JNK 主要包括JNK1、JNK2、JNK3 3 個成員，其中JNK3 是JNK 信號通路中非常重要的異構體之一，主要分布在中樞神經腦組織中，與神經元的凋亡關系密切[12，13]。大量的炎性介質、細胞因子、應激可以激活JNK3及其后的信號轉導，有研究表明[14]，帕金森病患者中JNK3 磷酸化可導致神經元損傷。此外，JNK3 可介導百草枯和魚藤酮誘導的多巴胺能神經元死亡[15]。JNK3 還可啟動Bcl-2、Caspase-3 等信號，介導神經細胞凋亡[16]。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）為細胞凋亡途徑中的重要因子，在調節細胞凋亡過程中具有重要意義[17]。帕金森病動物實驗中發現[18]，腦細胞發生凋亡形態改變，其中有Caspase-3 被激活。Zhang Y 等[19]研究表明，在肌萎縮性脊髓側索硬化癥動物模型中，Caspase-1 和Caspase-3 被激活，同時發現Caspase-1 和Caspase-3的mRNA 表達水平明顯增加。王麗晶等[20]在腦卒中相關性肌萎縮實驗模型中發現，抑制Caspase-3 通路激活，可抑制肌細胞凋亡，增加肌纖維橫截面積，對抗腦卒中相關性肌萎縮。本研究中Thapsigargin 組JNK3、Caspase-3 蛋白表達高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示JNK3、Caspase-3 可能參與了神經細胞損傷過程。Caspase-3 作為腦缺血損傷中發生神經細胞凋亡的一個關鍵酶以及執行者，抑制Caspase-3的活性，可在一定程度上減緩或阻止缺血性腦卒中的進程。

綜上所述，經Thapsigargin 處理后PC12 細胞凋亡率增加，JNK3、Caspase-3 蛋白表達增加，推測Thapsigargin 誘導的神經元內質網應激中，可通過激活JNK3及其后的信號通路，促進Caspase-3 表達，介導神經細胞凋亡。