不同品種箬竹葉生化成分及抗氧化能力分析

張亞蘭，趙建誠，楊振亞，石 瑞，李 琴，王衍彬，賀 亮, ，陳永健

（1.國家林業局竹筍工程技術研究中心，浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；2.南京林業大學輕工與食品學院，江蘇南京 210037；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江湖州 313399）

箬竹（Indocalamus）為禾本科，箬竹屬植物[1]，箬竹葉片的長、寬度適宜，并含有獨特的香氣，是千百年來我國端午節粽葉的主要來源。在很長一段時間里，箬竹葉作為粽葉僅為食材包裝所使用，用后多被棄為廚余垃圾，很少有人考慮其功能性作用[1]。近幾年，人們開始對竹葉的功能性進行研究，箬竹葉營養價值豐富，富含多種微量元素，功能性成分。包括竹葉中多種多樣的化學物質和生理能力成分。

研究表明，竹葉提取物中含有大量的酚類、酯類、黃酮、氨基酸及多種微量元素，具有抗氧化能力、抗衰老能力[2]，并可以調節人體循環系統和生理功能，還有抗菌、抑菌等功能[3]，對人體有重要作用。因此，對竹葉醇提取物進行抗氧化能力研究是有依據，并有研究價值的。目前，除了對竹葉提取物的生理功能有大量研究外，也有研究人員對箬竹葉的各種功能性成分進行了提取及研究，包括氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、灰分等營養成分[1]以及黃酮[4?5]、多糖[6?7]、礦質元素[8]、多酚[9]等功能性成分。但這些研究是單一的，而且并未對多種箬竹葉的功能性成分差異進行具體分析。因此，本研究對不同品種箬竹葉的生化成分含量和抗氧化能力差異進行了分析。

本研究主要以浙江省林業科學研究院內浙江竹種園的11種箬竹資源為對象，不同種箬竹葉的總黃酮、多糖、多酚、揮發油四種功能性成分含量及其抗氧化能力能力差異。先利用國家標準測量其營養成分，再分別用不同的提取方法提取粗產品，即水提（多糖）和醇提（總黃酮、多酚）。利用標準品制備標準曲線，擬合回歸方程，求得其含量。其次對其竹葉醇提取物進行DPPH自由基、超氧陰離子及羥自由基清除率的比較。最后綜合各方面比較11種樣品的優劣。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

11種箬竹葉（矮箬竹、髯毛箬竹、闊葉箬竹、長節箬竹、美麗箬竹、長耳箬竹、泡箬竹、華箬竹、天目箬竹、勝利箬竹和米箬竹） 浙江省林業科學研究院竹類植物園；Al（NO3）3、蘆丁、無水葡萄糖、NaNO2、苯酚、Na2CO3、ZnSO4、乙酸乙酯、鄰苯三酚、FeSO4、沒食子酸、DPPH、H2O2、正己烷、CH2Cl2分析純，成都市科隆化學品有限公司；NaOH、濃硫酸 分析純，杭州化學試劑有限公司（監制）；95%乙醇 分析純，杭州匯普化工儀器有限公司；福林酚試劑、鹽酸優級純，國藥集團化學試劑有限公司。

Sartorius BSA 224S型電子天平 賽多利斯Sartorius科學儀器有限公司；DFT-150多功能高速中藥粉碎機 溫州頂歷醫療器械有限公司；真空冷凍干燥機 LABCONCO公司；heating Bath B-491水浴鍋、Rotavapor R-210旋轉蒸發儀 BUCHI公司；Centrifuge 5804R冷凍離心機 Eppendorf公司；超聲波清洗機 南京賽飛生物科技有限公司；HITACHI U-1900紫外可見分光光度計 株式會社日立制作所；HH-2K4二列四孔型水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品來源及處理 采集的樣品全部來源于浙江省林業科學研究院竹類植物園，采集矮箬竹、髯毛箬竹、闊葉箬竹、長節箬竹、美麗箬竹、長耳箬竹、泡箬竹、華箬竹、天目箬竹、勝利箬竹和米箬竹的竹葉，對其水含量進行測定過后，放置在室溫下，自然風干。最后使用粉碎機粉碎，裝至密封袋中干燥保存。在開始實驗前再進行烘干處理，采用絕干樣品進行實驗，減少實驗誤差。

1.2.2 竹葉營養成分含量的測定 所有成分的含量檢測均采用最近幾年公布的國家標準。其中，粗蛋白含量測定采用GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法；采用GB 5009.3-2016中的直接干燥法測定含水量；粗脂肪測定采用GB/T 14772-2008中的直接滴定法；參照GB 5009.4-2016的方法測定灰分含量。

1.2.3 功能性成分提取及測定

1.2.3.1 多糖提取及含量測定 多糖提?。壕C合文獻[10?12]的方法，采用簡單的水提法。將蒸餾水與11種樣品分別以料液比1:20進行均勻混合，90 ℃水浴水提2 h。減壓過濾，將濾渣丟棄，留下濾液，將其在60～70 ℃旋蒸儀上加熱濃縮汁原體積至1/3后結束旋蒸，按體積比1:4加入95%乙醇進行沉淀24 h。將上清液（95%乙醇）倒去少許后分裝至50 mL離心管，7500 r/min離心5 min。放入冷凍干燥機干燥24 h，得粗多糖。

多糖含量測定：多糖含量參考張倩茹等[13]的方法改進苯酚-硫酸法進行測定。制備100 μg/mL葡萄糖標準溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL葡萄糖溶液置于20 mL具塞試管中，每支試管加蒸餾水補至2 mL，在通風櫥中加入1 mL的5%苯酚溶液混勻，然后快速加入5 mL濃硫酸混勻。室溫靜置10 min，放入30 ℃水浴加熱20 min。在490 nm下（使用上述空白試劑試管調節零點）測定吸光值ABS，以吸光值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，擬合標準曲線為y=12.354x?0.0032，R2=0.9994。稱取11種黃酮樣品各30 mg，將其溶解并定容10 mL。從每個樣品溶液中吸取0.2 mL多糖待測液按照相同方法測定吸光度。

1.2.3.2 黃酮提取及含量測定 黃酮提?。簠⒖嘉墨I[4,14]的方法通過適當調整進行醇提。將60%乙醇與11種樣品分別以料液比1:30進行均勻混合，65℃水浴醇提2 h。減壓過濾，保留濾液，將其60～65℃旋蒸濃縮至原體積1/4后分裝至20 mL離心管，封上封口膜后放入?80℃冰箱冷凍2 h，最后放入凍干機48 h，得粗黃酮。

黃酮含量測定：參考相關文獻[15?16]，采用Al（NO3）3絡合分光光度法。分別取200 μg/mL蘆丁標準溶液0、0.25、0.5、1、2、3、4、5 mL置于20 mL具塞試管中，加60%乙醇補至5 mL，加1 mL 50 g/L NaNO2溶液，室溫靜置5 min。加1.5 mL 100 g/L Al（NO3）3溶液，室溫靜置6 min。加4 mL 200 g/L NaOH溶液，室溫靜置10 min。在510 nm下，使用上述空白試劑試管調節零點，記錄吸光值，以吸光值為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，制作標準曲線為y=4.9395x?0.0055，R2=0.9992。分別稱取11種樣品30 mg，溶解于20 mL具塞試管中，利用相同操作測定吸光度。

1.2.3.3 多酚提取及含量測定 多酚提?。簠⒖嘉墨I[12,17?18]得出的最佳提取條件，采用超聲波輔助醇提。將50%乙醇與11種樣品分別以料液比1:15進行均勻混合，超聲提取40 min。減壓過濾，將濾餅丟棄，留下濾液即多酚待測液。向濾液加入沉淀劑Zn2+（硫酸鋅:樣品=0.5:1.6）來形成螯合物沉淀多酚，并使用7.5% NaCO3溶液調節pH6～6.5。沉淀完后，將溶液分裝離心，留下沉淀，加入適量2 mol/L鹽酸轉溶，加入10 mL乙酸乙酯進行萃取，收集乙酸乙酯層于梨形瓶中。將液體放在65 ℃旋蒸儀上減壓蒸餾至浸膏狀。將梨形瓶放入80 ℃干燥箱內干燥，得高純度多酚。

多酚含量測定：采用Folin-Ciocalteu比色法[19]測定，制備0.234 mg/mL沒食子酸標準溶液，分別取0、0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL于20 mL具塞試管中，加蒸餾水至2 mL。加入0.5 mL福林酚試劑混勻，室溫靜置3 min。加入4 mL 7.5% NaCO3溶液，混勻后室溫靜置1 h。在744 nm下，使用上述空白試劑試管調節零點，測定吸光值ABS，以吸光值為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，擬合標準曲線為y=57.875x+0.0076，R2=0.9997。稱取11種多酚待測樣30 mg左右于20 mL具塞試管中，按照相同的方法測定吸光度。

1.2.3.4 揮發油提取及含量測定 參考楊萍等[20]的方法，用同時蒸餾萃取法提取揮發油。分別取不同箬竹葉樣品60 g，放入1 L的燒瓶中，以樣品:蒸餾水=1:8加入蒸餾水，連接在同時蒸餾萃取裝置左側樣品進樣口。在250 mL蒸餾瓶中加入60 mL CH2Cl2，連接同時蒸餾萃取裝置的右側萃取劑進樣口，65 ℃水浴加熱左側裝有CH2Cl2的燒瓶，同時用電熱套加熱左側裝樣品的燒瓶，提取8 h。將放置CH2Cl2的燒瓶取下，將中間出口收集裝置中的CH2Cl2于此燒瓶中，使用45 ℃旋轉蒸發儀將CH2Cl2蒸出，將揮發油避光4 ℃保存。揮發油含量（%）=揮發油的質量／箬竹葉樣品的質量×100。

1.2.4 竹葉醇提取物 參考劉怡菲[21]的方法進行，采用超聲波輔助乙醇浸提法獲得不同品種箬竹葉醇提取物。準確稱取11種箬竹葉各10 g于500 mL燒瓶中。加入30倍體積的60%乙醇溶液，45 ℃超聲提取1.5 h，將浸提物進行真空抽濾，收集濾液。將濾液于55 ℃旋轉蒸發儀去除大量乙醇后，得箬竹葉醇提取物，保存至4 ℃冰箱中，備用。

1.2.5 抗氧化能力測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除率參照Zhang等[22?23]的方法，取DPPH樣品用無水乙醇制備0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于100 mL棕色容量瓶中，避光保存，用蒸餾水分別將11種箬竹葉醇提取物稀釋成質量濃度為0.60 mg/mL，取2 mL樣品溶液與3 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于10 mL具塞試管中，混勻后避光反應1 h。在517 nm下測吸光值，使用無水乙醇調零。DPPH自由基清除率（%）=[1?（DPPH樣品混合液的吸光值－樣品本身的吸光值）／DPPH乙醇溶液吸光值]×100。

1.2.5.2 超氧陰離子清除能力 采用王紫薇等[24]的方法，將不同品種箬竹葉醇提取物用蒸餾水分別稀釋為0.50 mg/mL醇提取物溶液，取1.0 mL的醇提取物溶液于10 mL具塞試管中，加入4 mL Tris-HCl緩沖液，室溫反應20 min，加入0.3 mL 5 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分反應，在420 nm下測吸光值，用1 mL蒸餾水替代樣品作為空白對照組。超氧陰離子清除率（%）=（1?樣品混合液的吸光值／空白對照組的吸光值）×100。

1.2.5.3 羥自由基的清除能力 參考王紫薇等[24]的方法，將箬竹葉醇提取物用蒸餾水稀釋成質量濃度為0.50 mg/mL醇提取物溶液，取1 mL醇提取物溶液于20 mL具塞試管中，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4、1.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）、1.5 mL 7.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液以及1 mL 0.01% H2O2溶液混勻，在37 ℃水浴中反應半小時。在510 nm下測吸光值，用1 mL蒸餾水替代樣品作為空白對照組。計算公式如下：羥自由基清除率（%）=[1?（樣品混合溶液吸光值?樣品本身吸光值）／空白對照組吸光值）]×100。

1.3 數據處理

對實驗數據通過Excel以及SPSS 19.0整理分析。不同品種的每個成分含量測3次，結果取3次測定值的平均值，用平均值±標準差（mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 不同品種箬竹葉營養成分含量差異

不同箬竹葉營養成分含量見表1，11種箬竹葉的水分含量在30%～40%之間，粗蛋白含量在20%左右，粗脂肪含量在5%左右，灰分在13%～16%之間。不同品種的營養成分含量差異大小，通過變異系數來體現，變異系數沒有量綱，可以進行更為客觀的比較[25]。同一地區不同品種的各營養成分含量存在顯著差異（P<0.05），四種營養成分的變異系數，只有粗蛋白的為13.93%，其他三種變異系數不超過10%。不同箬竹葉的水分含量變異系數是6.96%，華箬竹的水分含量最高，達39.86%±0.20%；而矮箬竹的水分含量最低，僅31.67%±0.23%。不同箬竹葉粗蛋白含量的變異系數是13.93%，含量最高的是矮箬竹，有26.12%±0.41%；其次是米箬竹，含有24.72%±0.49%；而含量最低的是美麗箬竹，僅有16.68%±0.42%。不同箬竹葉粗脂肪含量的變異系數是7.53%，含量最高的是勝利箬竹，達到5.21%±0.06%；其次是闊葉箬竹含有5.18%±0.08%；而粗脂肪含量最低的是天目箬竹，僅有4.10%±0.07%。不同品種灰分含量的變異系數是4.87%，含量最高的是闊葉箬竹，含有15.17%±0.04%，其次是長節箬竹，含有15.06%±0.03%；而含量最低的是米箬竹，僅含有13.15%±0.02%。從表1可以看出，11種箬竹葉的四種基本營養成分中，水分、粗脂肪、灰分這三種成分的含量兩兩相較差異較小，粗蛋白含量的差異性較大。

表1 不同箬竹葉營養成分含量差異Table 1 Differences of nutrient contents in different Indocalamus leaves

2.2 不同品種箬竹葉功能性成分含量差異

不同箬竹葉功能性成分含量見表2，多酚含量波動最大，在0.17%～0.62%范圍內；多糖含量在0.24%～0.69%之間，黃酮含量在0.25%～0.68%之間，也有較大變化幅度；揮發油含量在0.36%～0.64%之間，變化幅度較小。不同箬竹葉黃酮含量的變異系數為34.47%，長節箬竹的黃酮含量最高，為0.68%±0.07%，其次是闊葉箬竹有0.67%±0.06%；而黃酮含量最低的泡箬竹，僅有0.25%±0.03%。含量最高的比含量最低的高出不止3倍，可見其含量差異之大。11個品種中多糖含量最高的是髯毛箬竹，含有0.69%±0.04%；而含量最低的是米箬竹，僅有0.24%±0.02%。不同品種多糖含量的變異系數是28.03%。對于多酚含量的結果，其變異系數是38.04%，含量最高的是長節箬竹（0.62%±0.09%），其次是勝利箬竹有0.54%±0.06%；多酚含量最低的是米箬竹，僅有0.17%±0.01%。長節箬竹多酚含量是米箬竹的近4倍，差異明顯。不同品種揮發油含量的變異系數是22.36%，含量最高的是闊葉箬竹，為0.64%±0.05%，其次是天目箬竹有0.59%±0.05%；揮發油含量最低的是勝利箬竹，僅有0.36%±0.03%。從表中結果也可以看出，同一地區不同品種四種功能性成分中箬竹葉揮發油含量的差異性并不大，相較而言，黃酮、多糖和多酚含量的差異就明顯較大。

表2 不同箬竹葉功能性成分含量差異Table 2 Differences in contents of functional components in different Indocalamus leaves

2.3 不同品種箬竹葉抗氧化能力差異

表3表示了同一地區不同箬竹葉抗氧化能力的差異，箬竹葉醇提取物對DPPH自由基、超氧陰離子及羥自由基清除率可以表示抗氧化的能力。不同箬竹葉DPPH自由基清除率的范圍為53.76%～65.07%，變異系數為5.70%，清除率最高的是長耳箬竹，達到65.07%±0.33%；此外，長節箬竹、勝利箬竹、天目箬竹都有較高的清除率，分別是63.02%±0.40%、63.44%±0.37%、62.16%±0.25%；清除率最低的是矮箬竹，為53.76%±0.27%。不同箬竹葉超氧陰離子清除率的范圍是36.12%～47.26%，變異系數為7.86%，清除率最高的是天目箬竹，達47.26%±0.34%；其次是闊葉箬竹，達到45.40%±0.44%；最低的是泡箬竹，清除率為36.12%±0.30%。箬竹葉羥自由基清除率在62.01%～77.24%，變異系數為5.99%，清除率最高的是長節箬竹，達到77.24%±0.41%；其次是天目箬竹，達到75.93%±0.49%；最低的是米箬竹，清除率為62.01%±0.52%。11種品種中，DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基三種清除率的變異系數均不超過10%。相較于功能性成分含量差異，抗氧化能力的差異相對較小，變幅并不大。

表3 不同箬竹葉抗氧化能力差異Table 3 The difference in antioxidant activity of different Indocalamus leaves

2.4 不同箬竹葉權重分析及綜合評分

2.4.1 抗氧化能力權重分析 為了方便進行最終的權重分析和綜合評分，所以先將抗氧化能力歸納為一組數據。把DPPH自由基、超氧陰離子及羥自由基清除率，設為同等重要。每組數據的最大值作為1，最小值作為0，然后將所有數據歸一化。由于重要程度相同，則公式為Y=Y1×1/3+Y2×1/3+Y3×1/3。

從最終的得值可以看出（表4），天目箬竹竹葉醇提取物的抗氧化能力最強，得分達0.8856；此外長節箬竹、長耳箬竹、髯毛箬竹的竹葉醇提取物的抗氧化能力相對較強，得分分別為0.7113、0.6182、0.5795；而矮箬竹的抗氧化能力最弱，僅得分0.0991。

表4 抗氧化能力數據歸一化Table 4 Normalization of antioxidant activity data

2.4.2 功能性成分及抗氧化能力權重分析 諸多研究[23,26]可以看出，黃酮作為箬竹葉的主要功能性成分，重要性更高。因此，將黃酮含量的重要性設為最高，多糖含量、多酚含量及抗氧化能力次之，揮發油含量的重要性最低。由此，進行權重分析。

2.4.2.1 功能性成分數據歸一化 將每組數據的最大值作為1，將所有數據歸一化，見表5。

表5 功能性成分含量數據歸一化Table 5 Normalization of functional ingredient content data

2.4.2.2 功能性成分、抗氧化能力權重分析及綜合評分 使用AHP層次分析法[27?28]確定權重系數，根據箬竹葉功能性成分含量及抗氧化能力在之后工業上的應用，決定其重要程度。將黃酮含量設為重要，多糖含量、多酚含量及抗氧化能力設為比較重要，揮發油含量設為比較不重要。構成兩兩比較優先判斷矩陣（表6）。

表6 功能性成分及抗氧化能力優先判斷矩陣Table 6 Functional ingredients and antioxidant activity priority judgment matrix

根據優先判斷矩陣使用SPSS在線分析系統，計算（計算方式參考李慧敏[29]）得出各指標權重系數，黃酮含量A為0.3485，多糖含量B、多酚含量C及抗氧化能力Y均為0.1846，揮發油D為0.0978。經一致性檢驗得出CR=0.0022<0.1,表明各指標的優先判斷矩陣具有一致性,所得權重系數有效。則其綜合評分結果Z=0.3485×A+0.1846×（B+C+Y）+0.0978×D。

從圖1可以看出，天目箬竹得分最高，有0.8108，此外還有兩種箬竹葉的評分較高，分別是長節箬竹和闊葉箬竹，分別得分0.7808和0.7678；髯毛箬竹、美麗箬竹、長耳箬竹得分稍低，分別得分0.5147、0.4817、0.5314；矮箬竹和勝利箬竹相比較得分更低，得分0.3975和0.3661；得分更低的是泡箬竹0.1903分和華箬竹0.2471分；得分最低的是米箬竹，僅得分0.0700。從綜合評分的結果看出，天目箬竹的得分最高，是最好的加工原材料。盡管天目箬竹葉在功能性成分含量的單項中并不是最高的，但多項綜合之后，卻是最高的。加上其醇提取物的抗氧化能力是最高的，使其成為加工的首選箬竹葉原料。

圖1 功能性成分及抗氧化能力權重分析綜合評分Fig.1 Comprehensive score analysis of functional ingredients and antioxidant activity weights

3 結論

研究結果中出現了幾種功能性成分單項數據很高的箬竹葉品種，如果進行單獨提取某方面的研究，可以選擇單項含量較高的品種。比如，黃酮含量最高的是長節箬竹和闊葉箬竹，分別為0.68±0.07%和0.67±0.06%；多糖含量最高的是髯毛箬竹，含有0.69±0.04%；多酚含量最高的是長節箬竹，含有0.62±0.09%，明顯高于其他品種；揮發油含量最高的闊葉箬竹，含量為0.64±0.05%?？寡趸芰ψ顝姷氖翘炷矿柚?，得分0.8856。

功能性成分含量的單項差異和綜合評分的結果可以為箬竹葉的開發選品提供重要參考。闊葉箬竹和長節箬竹這兩種的綜合評分很可觀，僅比天目箬竹的綜合評分低0.043和0.030，而且這兩種的黃酮含量很高，是非常好的開發原料。從不同箬竹葉的營養成分差異中，可以看出箬竹葉是一種蛋白質提取的有效來源，而粗脂肪的存在無論對于蛋白質提取還是其他功能性成分的提取都是一種阻礙，所以對于箬竹葉的加工，還是需要粗脂肪含量更低的品種。天目箬竹的粗脂肪含量最低，并且最終在功能性成分及抗氧化能力綜合評分中得分最高。所以天目箬竹的竹葉是綜合開發的最佳選材。