HPLC法測定鹽酸替羅非班注射液中光學異構體

胡小燕，石勝男，薛允寧

分析檢測

HPLC法測定鹽酸替羅非班注射液中光學異構體

胡小燕，石勝男，薛允寧

（沈陽新馬藥業有限公司，遼寧 沈陽 110102）

建立鹽酸替羅非班注射液光學異構體的測定方法。色譜柱采用CHIRALPAK? IC手性色譜柱，流動相為（正己烷）∶（異丙醇）∶（甲醇）∶（三氟乙酸）∶（無水乙二胺）=40∶40∶20∶0.3∶0.3。檢測波長227 nm，流速0.8 mL·min-1。重點針對樣品的制備方法進行考察，對樣品處理方式、稀釋劑配比和超聲時間進行了篩選，確定采用旋蒸除水然后稀釋劑提取的方式制備供試品溶液。該方法專屬性、線性、靈敏度、耐用性均良好，適用于鹽酸替羅非班注射液中光學異構體的檢測。

HPLC法；鹽酸替羅非班注射液； 光學異構體

鹽酸替羅非班（Tirofiban hydrochloride）為非肽類血小板表面糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑，臨床上常與肝素連用，用于預防不穩定型心絞痛或非Q波心肌梗塞病人，預防心臟缺血事件，同時也適用于冠脈缺血綜合征病人進行冠脈血管成形術或冠脈內斑塊切除術，以預防與經治冠脈突然閉塞有關的心臟缺血并發癥[1-6]。

鹽酸替羅非班化學名為N-(正丁基磺?；?-O- [4-(4-哌啶基)丁基]-L-酪氨酸鹽酸鹽一水合物，分子式為C22H36N2O5S·HCl·H2O，分子量為495.08。結構中含有L構型酪氨酸片段，D構型為合成工藝中引入的光學異構體[7]，需在藥品標準中作為雜質進行控制，本文參考鹽酸替羅非班質量標準和相關文獻[8-11]，對樣品前處理方法重點進行了考察，采用HPLC法測定鹽酸替羅非班注射液中的光學異構體。經規范的方法驗證[12-14]，本法適合鹽酸替羅非班注射液中光學異構體的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器

BP211D型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Agilent 1260 VWD 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Agilent 1260 DAD 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；變色龍工作站Chromeleon 7.2.10 ES；RE-52A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）CHIRALPAK? IC手性色譜柱，250 mm×4.6 mm，5μm（大賽璐藥物手性技術（上海）有限公司）。

1.2 試劑

樣品：鹽酸替羅非班注射液（批號：04210601，通遼華邦藥業有限公司），正己烷（色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；異丙醇（色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；甲醇（色譜純，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；三氟乙酸（分析純，山東西亞化學試劑）；無水乙二胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜條件：采用CHIRALPAK? IC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以（正己烷）∶（丙醇）∶（甲醇）∶（三氟乙酸）∶（無水乙二胺）=40∶40∶20∶0.3∶0.3為流動相；流速為每分鐘0.8 mL；柱溫為35 ℃；檢測波長為227 nm；進樣體積為50μL。

2.2 對照溶液的制備

精密量取供試品溶液適量，加上述稀釋劑稀釋制成每1 mL中約含替羅非班1.25μg的溶液。

2.3 供試品溶液制備方法的考察

1）樣品提取方式的選擇

本品鹽酸替羅非班注射液為滅菌水溶液，所選擇的分析方法采用正相體系進樣高效液相色譜儀，無法采用直接稀釋定容的方式制備樣品，需將樣品中水分除去后再進一步處理制備成供試品溶液。鹽酸替羅非班在甲醇、冰醋酸中極易溶解，在水中微溶。如果采用萃取的方式并無合適的萃取溶劑，本品采用旋轉蒸發將水分低溫（30～60 ℃）去除后，用稀釋劑提取并稀釋定容。

2）稀釋劑的選擇

本品藥液經旋轉蒸發儀蒸干，殘渣為白色固體粉末，其中鹽酸替羅非班僅占固體粉末重量的2.25%，其他為處方中的輔料。為將殘渣中鹽酸替羅非班充分提取，需考察稀釋劑的組成。參考標準[6]中采用（正己烷）∶（異丙醇）∶（甲醇）=20∶30∶50作為稀釋劑，將該稀釋劑用于鹽酸替羅非班注射液蒸發殘渣的提取，發現主成分回收率偏低，考慮到鹽酸替羅非班在甲醇中溶解度較好，提高稀釋劑中甲醇的比例，調整為（正己烷）∶（異丙醇）∶（甲醇）=10∶15∶75，殘渣的提取溶液中主成分回收率明顯提高。

由于鹽酸替羅非班注射液中異構體為未檢出，上述用于稀釋劑篩選的樣品為按限度（0.2%）添加異構體的鹽酸替羅非班注射液。

兩種稀釋劑的提取效率對比結果見表1。

表1 稀釋劑的選擇

對比結果顯示稀釋劑2提取率好于稀釋劑1，所以選擇（正己烷）∶（異丙醇）∶（甲醇）=10∶15∶75作為異構體方法中的稀釋劑。

3）超聲提取時間的確定

供試品溶液制備方法建立過程中，對超聲提取的時間進行了篩選，篩選結果如表2。

表2 超聲提取時間的選擇

超聲5 min、10 min、15 min的異構體檢測結果無明顯差異，所以超聲時間折中選擇了10 min。

供試品溶液的制備精密量取本品10 mL，置旋轉蒸發器上蒸干，精密加入稀釋劑（正己烷）∶（異丙醇）∶（甲醇）=10∶15∶75 10 mL，超聲10 min，濾過，即得。

2.4 檢測波長的確定

與參考文獻[9]中描述一致，UV掃描結果顯示除末端吸收外最大吸收波長為227 nm，所以將檢測波長確定為227 nm。

圖1 鹽酸替羅非班紫外掃描圖譜

2.5 專屬性試驗

酸破壞試驗：取供試品溶液10 mL，置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液2 mL，置80 ℃水浴加熱4 h，放冷，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液2 mL中和，置旋轉蒸發器上蒸干，精密量取稀釋劑10 mL，超聲10 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

堿破壞試驗：取鹽酸替羅非班注射液10 mL，置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液2 mL，置80 ℃水浴加熱4 h，放冷，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液2 mL中和，置旋轉蒸發器上蒸干，精密量取稀釋劑10 mL，超聲10 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

氧化破壞試驗：取鹽酸替羅非班注射液10 mL，置25 mL量瓶中，加1%過氧化氫溶液1 mL，置80 ℃水浴加熱1 h，放冷，置旋轉蒸發器上蒸干，精密量取稀釋劑10 mL，超聲10 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

高溫破壞試驗：取鹽酸替羅非班注射液10 mL，置80 ℃水浴加熱8 h，置旋轉蒸發器上蒸干，精密量取稀釋劑10 mL，超聲10 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

光照破壞試驗：取替羅非班注射液10 mL，在（4 500±500）lx的光照強度下放置4 d。置旋轉蒸發器上蒸干，精密量取稀釋劑10 mL，超聲10 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

將按照上述破壞條件制備的供試液按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖（圖2）。各破壞條件下目標峰與相鄰雜質峰的分離度均符合要求。

2.6 線性關系、檢測限與定量限考察

精密稱量鹽酸替羅非班對照品適量，用稀釋劑制成含替羅非班質量濃度分別為0.248 5、0.397 7、0.497 1、0.745 6、1.242 7、2.485 4 μg·mL-1的溶液，按照光學異構體色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：=1.695 5- 0.068 7（=0.999 4）。替羅非班0.248 5～2.485 4 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系。

取對照品溶液，逐級稀釋，分別進樣檢測，記錄色譜圖，得替羅非班檢測限（S/N≌3）和定量限（S/N≌10）分別為4.97 ng、9.07 ng。

2.7 耐用性試驗

考察在柱溫、流速、波長及流動相比例發生微小變化時，主峰與光學異構體的分離度情況及異構體的檢測情況，結果在不同變換條件下檢測同一批供試品，系統適用性溶液主峰與異構體峰分離度均大于2.0，表明方法耐用性良好。異構體含量RSD為4.83%。符合可接受標準[13]。

2.8 光學異構體檢測

精密量取供試品溶液與對照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有替羅非班異構體峰，其峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.4倍（0.2%）。

3 結論

本文重點針對樣品的制備方法進行考察，對樣品處理方式、稀釋劑配比和超聲時間進行了考察，確定采用旋蒸除水然后提取的方式制備供試品溶液。色譜條件為CHIRALPAK? IC手性色譜柱，流動相為（正己烷）∶（異丙醇）∶（甲醇）∶（三氟乙酸）∶（無水乙二胺）=40∶40∶20∶0.3∶0.3。該方法經驗證，專屬性、線性、靈敏度、耐用性均良好，本方法適用于鹽酸替羅非班注射液中光學異構體的檢測，可以有效控制產品質量。

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Determination of Optical Isomers in Tirofiban hydrochloride injection by HPLC

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（Shenyang Xinma Pharmaceutical Co., Ltd., Shenyang Liaoning 110102, China）

A method for the determination of optical isomers in tirofiban hydrochloride injection was established. The chromatographic column was CHIRALPAK? IC, and the mobile phase consisted of n-hexane-isopropanol- methanol-trifluoroacetic acid-anhydrous ethylenediamine (40∶40∶20∶0.3∶0.3). The detection wavelength was 227 nm, and the flow rate was 0.8 mL·min-1. The preparation method of the sample was studied, sample treatment method, diluent ratio and ultrasonic time were screened, it was determined to use rotary evaporation to remove water and then diluent extraction to prepare the test solution. The method has good specificity, linearity, sensitivity and durability, and is suitable for the determination of optical isomers in tirofiban hydrochloride injection.

HPLC method; Tirofiban hydrochloride injection; Optical isomers

O657

A

1004-0935（2022）04-0569-04

2021-12-06

胡小燕（1981-），女，黑龍江省雙鴨山市人，工程師，碩士研究生，2006年畢業于沈陽藥科大學中藥學院天然藥物化學專業，研究方向：藥品質量研究。