黃瓜耐鹽種質資源的篩選與評價

曹齊衛 杜連達 楊宗輝 李利斌 段 曦 楊文強 陳 偉 孟昭娟,*

(1 山東省農業科學院蔬菜研究所/國家蔬菜改良中心山東分中心/山東省設施蔬菜生物學重點實驗室/農業農村部黃淮地區蔬菜科學觀測實驗站(山東)，山東 濟南 250100；2 山東農業大學，山東 泰安 271018；3 山東農業工程學院，山東 濟南 250100)

黃瓜(CucumissativusL.)是一種重要的經濟作物，在世界范圍內廣泛種植[1]，在我國具有重要的產業地位。連作障礙是當前黃瓜產業發展的瓶頸[2]，其中土壤鹽漬化是導致連作障礙的重要原因。連作障礙會導致黃瓜植株生長發育受阻[3]，影響其產量和品質[4]，降低農戶收益。因此，從解決鹽害的角度出發，篩選培育耐鹽堿的黃瓜品種是減少鹽害以及利用鹽漬化土地種植黃瓜的有效途徑之一[5]。

杜長霞等[6]研究發現，在鹽脅迫下，黃瓜幼苗的干鮮重明顯下降，并且幼苗的莖粗、植株高度、葉片數、葉片面積等生長指標均受到嚴重抑制。有研究發現在鹽脅迫下，光合作用是植株較敏感的生理生化代謝反應[7]，而植株的光合能力下降的主要原因之一是其光合作用所需的色素在鹽脅迫下含量降低[8]。鹽脅迫下，黃瓜幼苗還會產生一系列的生化指標變化，在NaCl脅迫下會造成黃瓜幼苗的膜質過氧化，細胞膜的相對透性顯著增加、結構被破壞，并且葉片中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加[9]，因此MDA含量的積累與膜質過氧化呈正相關，膜質受到鹽害程度越高，幼苗中MDA含量越高[10]。當植物受到鹽脅迫時往往會表現為缺水狀態，這是由于土壤中有鹽離子的存在致使滲透失調，外界的水分難以被植物吸收從而使植物因嚴重缺水死亡。游離脯氨酸和過氧化物酶(peroxidase，POD)作為植物的重要滲透調節物質，在植物體內平衡滲透勢。研究表明，在鹽脅迫下，黃瓜幼苗內會產生大量的活性氧[11]，而黃瓜幼苗體內的POD、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等保護酶具有較強的抗氧化性，能夠清除活性氧，保護細胞免受氧化損傷[12]。綜上所述，在相同的鹽脅迫條件下，耐鹽黃瓜品種的MDA含量低于敏感品種，而脯氨酸含量和POD活性高于敏感品種[13]。

黃瓜為我國主要栽培蔬菜之一，被廣泛種植，生產上面臨的土壤鹽漬化問題日益顯著，而耐鹽種質資源較為匱乏。本研究通過測定21份黃瓜材料的耐鹽指數、葉綠素、保護酶等各項生理生化指標，篩選出較耐鹽黃瓜種質，以期為耐鹽品種選育和黃瓜耐鹽機理研究提供材料和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篩選鹽濃度所用種質的材料：白黃瓜(M1-2-h-10，海洋白皮高代自交系)、MC2065(新泰密刺改良系)。

21份栽培黃瓜種質材料：華北型材料13份，華南型材料4份，歐美溫室型材料3份，歐美加工型材料1份，詳見表1。試驗種子均由山東省農業科學院提供，栽培基質為瓜果專用固體基質，2021年1月統一種植于山東省農業科學院蔬菜所培養室。

表1 黃瓜材料類型及來源

本試驗所用藥品均由濟南博拓斯生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

D3024R臺式高速冷凍型微量離心機，大龍興創實驗儀器(北京)有限公司；HH系列數顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；MAPADA P5型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 NaCl脅迫適宜濃度篩選 選取飽滿、整齊度一致且無病蟲害的黃瓜種子于55℃溫水浸泡2 h后置于蒸餾水中，在28℃恒溫條件下吸脹12 h。待90%種子露白后，將白黃瓜、MC2065種子播種于固體基質的32孔穴的育苗盤中，置于智能光照培養架上培養。待白黃瓜、MC2065幼苗二葉一心時，分別用0、50、100、150、200、250 mmol·L-1的NaCl處理，每穴澆85 mL鹽水，處理3 d后觀察黃瓜幼苗表型，計算鹽害指數。

1.3.2 黃瓜幼苗NaCl處理方法 半致死NaCl濃度處理21份黃瓜，每個材料每個處理16株，二葉一心時，每株幼苗澆85 mL鹽水，3 d后測定形態指標。并取鮮樣用液氮冷凍處理置于50 mL試管中，3次重復，-80℃冰箱中保存用于生理生化指標測定。

1.3.3 鹽害癥狀分級標準 鹽害癥狀分級標準參考嚴勇亮等[14]的方法，并對耐鹽性分級標準進行改進，詳見圖1、表2。

表2 鹽害等級劃分

圖1 葉片鹽害等級(第1片真葉)

將得到的數據代入公式，計算鹽害指數：

鹽害指數=∑(代表級數×株數)/(總株數×最高級數)×100%。

1.3.4 生長指標測定 株高：用直尺測量莖基部到生長點之間的距離。莖粗：采用電子游標卡尺進行測量，測量的位置統一在莖基部。

1.3.5 鹽害指數與植株耐鹽性 根據鹽害指數，對照表3的分級標準確定耐鹽性。

表3 鹽害指數對應的耐鹽性

1.3.6 葉綠素含量測定 參考高俊鳳等[15]的方法。先按照體積比配制80%丙酮的提取液待用。24 h后可直接將試管中的綠色液體進行測量，即使用比色皿在分光光度計上測量663 nm以及645 nm波長下的吸光度值，根據公式計算葉綠素a(content of chlorophylla，Ca)和葉綠素b的含量(content of chlorophyllb，Cb)。

Ca=(12.71A663-2.59A645)V/(1 000 W)

Cb=(22.88A645-4.67A663)V/(1 000 W)

C總=Ca+Cb

式中，葉綠素含量的單位為mg·g-1；A663和A645分別為663 nm和645 nm波長下的吸光度值；V為提取溶劑體積，即10 mL；W為所取黃瓜葉片質量。

1.3.7 脯氨酸含量測定 采用酸性茚三酮法，具體步驟參考李合生[16]的方法。

1.3.8 抗氧化酶活性測定 參照André等[17]的方法并稍加改進。準確稱取0.1 g黃瓜葉片，放入預冷研缽中，加入0.04 g聚乙烯毗咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)，用1 mL預冷的提取緩沖液(K2HPO4-KH2PO4，pH值7.0，0.1 mmol·L-1EDTA，5 mmol·L-1巰基乙醇)充分研磨均勻，經兩步離心(4 500×g，4℃，10 min和16 000×g，4℃，15 min)，上清液即為酶粗提液。SOD和CAT活性的測定參考高俊鳳等[15]的方法；POD活性的測定采用愈創木酚顯色法[16]。

1.3.9 丙二醛(MDA)含量的測定 用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，參考李合生[16]的方法。

1.4 數據分析

對測得的黃瓜各項生理生化指標數據進行聚類分析，采用Microsoft Excel 2007制表、作圖，用軟件SPSS 22.0進行顯著性分析以及主成分分析。主成分分析計算參考王吉祥等[18]的方法。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫黃瓜適宜濃度的篩選

由表4可知，不同NaCl濃度處理白黃瓜和MC2065，幼苗的鹽害指數隨著鹽濃度的增大而升高。鹽濃度小于100 mmol·L-1時鹽害指數均為0。鹽濃度大于等于100 mmol·L-1時鹽害指數顯著提高，鹽濃度大于150 mmol·L-1時鹽害指數達到最大值，為100%。當鹽濃度為100 mmol·L-1時白黃瓜鹽害指數為35.94%，出現較明顯的鹽害脅迫，而MC2065鹽害指數為4.69%，沒有明顯的鹽害表現；當鹽濃度提高到150 mmol·L-1時兩者均表現出較明顯的鹽害脅迫，MC2065出現半數以下的葉片枯萎，而白黃瓜出現半數以上的葉片枯萎，萎蔫程度較明顯，呈現半致死狀態(圖2)，因此將100和150 mmol·L-1作為黃瓜耐鹽鑒定的適宜鹽濃度。

圖2 白黃瓜和MC2065在不同鹽濃度處理后的性狀表現

表4 不同NaCl脅迫對黃瓜鹽害指數影響

2.2 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗株高、莖粗的影響

在鹽脅迫下，21個種質的黃瓜幼苗株高、莖粗均受到不同程度的抑制，并且隨著鹽濃度的增高抑制程度越高。與CK相比，DY1、D1503、XB23和DRT345在100和150 mmol·L-1處理下株高均受到顯著抑制，抑制程度在28.33%以上。與CK相比，DRTJY-2和壽水1的株高只在150 mmol·L-1處理下受到顯著抑制，分別較CK降低60.00%和61.99%(圖3-A)。鹽濃度處理后不同種質的莖粗呈下降趨勢，同CK相比，XY1、壽水1在100 mmol·L-1處理下降幅度最大，分別下降了37.31%和46.47%；20S091-1在150 mmol·L-1處理下降幅度最小，為2.88%(圖3-B)。

圖3 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗株高、莖粗的影響

2.3 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗鹽害指數與存活率的影響

由表5可知，21種黃瓜幼苗的鹽害程度隨鹽脅迫濃度的增大而增大，鹽害指數也隨之增高。100 mmol·L-1處理下，DJ04、DY-1、DRTJY-2、YY9123、SJ11-1、M2XT、壽水1、HLT-921h、X805、DRT345、N26-5-1 一半以上的種質表現出鹽害癥狀。其中DJ04、M2XT、壽水1、N26-5-1的鹽害指數為10%，其余種質的鹽害指數為5%。而在150 mmol·L-1濃度處理下，所有黃瓜幼苗均表現出鹽害癥狀，其中DY-1、M2XT、20S077-1、DJ04、D1503、HLT-921h、XY1的鹽害程度較高，其鹽害指數達到45%以上，劃分為鹽敏感類群；而F-6-3-1、DRTJY-2、萊西、AZ-1、壽水1、DRT345的鹽害程度較低，其鹽害指數在30%以下，劃分為耐鹽類群。在0、100、150 mmol·L-1三組NaCl處理下，只有150 mmol·L-1處理黃瓜幼苗出現死亡現象，所以利用150 mmol·L-1NaCl濃度的存活率，比較各黃瓜種質的耐鹽性。其中萊西、壽水1、ZQ3、N26-5-1這4個黃瓜幼苗種質的存活率均為100%，而DY-1、D1503、XY1、DRT345這4個黃瓜種質的存活率較低，分別為18.18%、25.00%、27.27%、25.00%，DJ04和F-6-3-1這2個種質的黃瓜幼苗全部死亡。

表5 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗鹽害指數與存活率的影響

2.4 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

由圖4可知，黃瓜幼苗(除XB23、ZQ3、N26-5-1在150 mmol·L-1處理下)葉綠素含量在鹽脅迫下均下降，并且隨著鹽濃度的增加降幅升高。與CK相比，XY1、F-6-3-1在150 mmol·L-1處理下葉綠素含量下降最為明顯，分別下降89.43%、86.12%，而XB23、20S091-1、N26-5-1這3個種質的葉綠素含量下降較少，分別下降7.70%、2.48%、4.98%。

圖4 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

2.5 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗脯氨酸、抗氧化酶活性的影響

由圖5可知，與CK相比，隨著NaCl濃度增加，黃瓜幼苗的脯氨酸含量、SOD活性、POD活性及CAT活性整體呈上升趨勢，在150 mmol·L-1時差異最明顯。

與CK相比，在150 mmol·L-1處理下，DJ04、D1503、翠玉、壽水1、HLT-921h的脯氨酸增幅較大，分別上升1 208.66%、966.44%、646.54%、679.97%、776.26%(圖5-A)；SOD活性在SJ11-1、壽水1、HLT-921h、F-6-3-1中上升幅度較大，分別上升91.48%、94.93%、158.57%和118.59%。而DJ04、DY-1呈下降趨勢，分別下降4.75%、13.19%(圖5-B)；POD活性在DJ04、DRTJY-2、翠玉、萊西、XB23、20S091-1、20S077-1、ZQ3、N26-5-1中隨著鹽濃度的增加而上升，而DY-1、D1503、YY9123、AZ-1、SJ11-1、M2XT、X805、F-6-3-1的POD活性呈先升高后降低的趨勢，XY1、壽水1的POD活性呈先降低后升高的趨勢。與CK相比，在150 mmol·L-1處理下，HLT-921h、F-6-3-1的POD活性增幅較大，分別升高158.57%和129.38%(圖5-C)；與CK相比，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，D1503、X805的CAT活性增幅較大，分別上升251.09%和116.71%(圖5-D)。

圖5 NaCl脅迫對各種質黃瓜幼苗脯氨酸、抗氧化酶活性的影響

2.6 NaCl脅迫對6個代表種質MDA含量的影響

由圖6可知，在不同濃度的NaCl脅迫下，6個種質的MDA含量變化趨勢相同，均隨鹽脅迫濃度的增大呈上升趨勢。

圖6 NaCl脅迫對6個代表種質MDA含量的影響

相比于CK，在100 mmol·L-1NaCl脅迫下，萊西、D1503的增幅較為明顯，分別上升158.77%、574.55%；HLT-921h、YY9123增幅最小，分別上升2.31%和11.62%。在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，D1503的MDA含量增幅較為明顯，上升了817.93%；HLT-921h的增幅較小，上升46.22%。

2.7 黃瓜耐鹽性聚類分析

根據150 mmol·L-1處理下各黃瓜種質間區分度最大，利用SPSS軟件進行聚類分析，將供試的21份黃瓜種質分為3個類群(圖7)。第一類群包括ZQ3、N26-5-1、壽水1、DRTJY-2、萊西、翠玉、20S077-1，屬于耐鹽種質，是由對照種質和存活率共同決定的。第二類群包括DJ04、DY-1、XY1、YY9123、M2XT、D1503、X805，屬于中耐鹽種質。第三類群包括F6-3-1、SJ11-1、XB23、20S091-1、HLT-921h、AZ-1、DRT345，屬于鹽敏感種質。育種意義上，鹽敏感種質可通過與耐鹽類群相同生態型種質雜交創制耐鹽性較好的品種。

圖7 黃瓜種質聚類分群樹狀圖

2.8 黃瓜苗期耐鹽性主成分分析與綜合評價

從黃瓜幼苗生長量中選取株高、莖粗、葉綠素、鹽害指數、脯氨酸、SOD活性、POD活性、CAT活性、存活率9個指標，依據這9個指標進行主成分分析(表6)。結果表明，前4個主成分的特征值大于1，其方差貢獻率依次為31.66%、19.53%、15.42%、11.94%，累計方差貢獻率已達到78.55%，說明前4個主成分可以反映出9項耐鹽指標的大部分信息，因此提取前4個主成分對黃瓜耐鹽性進行綜合評價分析。

表6 黃瓜幼苗各成分的特征值及貢獻率

通過主成分模型計算黃瓜各種質的綜合得分，按得分排序得到表7。從排序結果可以看出，采用黃瓜幼苗9項指標主成分分析得出的綜合得分趨勢與黃瓜幼苗存活率高低趨勢基本一致，如N26-5-1和ZQ3黃瓜的存活率最高，其綜合得分也最高；DY1的存活率較低，其綜合得分亦較低。說明通過存活率篩選得出的結果與主成分分析法所得結果基本相符。

表7 不同黃瓜種質主成分綜合得分

3 討論

黃瓜為設施栽培的主要蔬菜之一，選擇耐鹽黃瓜品種，是非常重要的技術手段，選擇適宜的鹽成分及濃度是評價耐鹽種質的基礎。有大量文獻[19-20]均以NaCl作為鹽脅迫來研究黃瓜的耐鹽性。研究發現，環境中的Cl-和Na+含量升高導致的滲透脅迫造成植物受到傷害，細胞質中Cl-和Na+過量積累會產生離子毒害[21]。因此本研究采用NaCl脅迫處理黃瓜幼苗，測定相關指標篩選耐鹽種質資源，不僅能更真實地還原沿海地區的鹽漬地環境，還可以更準確地反映黃瓜耐鹽性。本研究篩選出的100、150 mmol·L-1NaCl脅迫濃度與曹齊衛等[22]、門立志等[23]研究結果相似，其中100 mmol·L-1NaCl可以作為篩選少量黃瓜材料的篩選鑒定濃度，而在150 mmol·L-1NaCl脅迫下鹽害指數達到50%以上，可用于高耐鹽種質的篩選。

本試驗采用4項形態指標、5項生理生化指標篩選鑒定21份黃瓜材料，其中株高、莖粗在鹽脅迫的條件下均受到抑制，并且其抑制程度隨著鹽脅迫濃度的提高而升高。本試驗中，所有黃瓜材料的葉片鹽害等級隨著鹽濃度的增大呈上升趨勢，說明濃度越高的鹽脅迫對植株造成的傷害越大，這與李衛欣等[24]在南瓜上的研究結果一致；本研究結果表明，在鹽脅迫條件下，黃瓜材料葉片中的葉綠素含量均下降，并且隨著鹽濃度的增加黃瓜幼苗的葉綠素降幅增大，是由于Na+大量積累,抑制了植株對K+、Mg2+的吸收，加劇了光抑制程度[25]，這與烏鳳章[26]在柑橘方面的研究結果一致。在較低濃度的鹽脅迫下，植物的葉綠素含量隨著鹽濃度的升高呈上升趨勢[27]，這是由于葉綠素的合成需要某些脯氨酸的參與,在較低濃度鹽脅迫下，細胞大量積累脯氨酸，從而有利于葉綠素的合成[28]，該現象與本研究中20S077-1、20S091-1的葉綠素變化趨勢一致；前人研究表明，在鹽脅迫下植物體內會積累大量的脯氨酸等滲透調節物質[29]，從而調節細胞質內的滲透，防止細胞的過度失水導致細胞死亡，并且脯氨酸還能穩定生物大分子的結構，調節細胞的pH值，消除毒害[30]。劉雪超等[31]研究發現，適當濃度的AgNO3可有效調節植物的滲透壓，降低過氧化程度；同時在鹽脅迫下，植物體內還會產生大量的ROS，ROS水平超出防御機制所及范圍，導致蛋白質氧化、酶失活。植物在逆境脅迫下會通過積累滲透調節物質和增加保護酶活性來抵抗逆境，因此耐鹽性與脯氨酸含量、保護酶活性的增長量呈正相關[32]，這與本試驗結果，即隨著NaCl濃度增加，黃瓜幼苗的脯氨酸含量、SOD活性、POD活性及CAT活性整體呈上升趨勢一致；在干旱和鹽脅迫下，甜菜葉片細胞會發生脂質過氧化，使細胞中積累大量的MDA[33]，因此MDA在植物體內積累量越小，代表其抗性越強。

通過各項單一指標結果發現，各黃瓜種質的耐鹽性評價差異性較大，僅用一項或者兩項指標無法準確篩選出黃瓜材料的耐鹽性，例如通過葉綠素指標表明DRT345的耐鹽性較強，這與研究結果一致。而通過株高指標表明DRT345為鹽敏感材料。因此本研究采用聚類分析與主成分分析綜合鑒定評價黃瓜材料的耐鹽性，對比結果發現，兩項綜合指標篩選出的耐鹽性材料基本一致，但DRTJY-2、XB23、20S091-1、翠玉的聚類結果與主成分分析結果存在較大的差異，這可能是兩種方法的計算方法和分類標準不同造成的。其中篩選出的耐鹽材料N26-5-1來源于中農26號，此種質在北京、河北、遼寧日光溫室栽培中表現出較強的耐鹽性[34]，說明本試驗的篩選方法較科學準確。門立志等[23]研究發現，在各耐鹽性指標中，地下部干重量、壯苗指數以及根冠比權重較大，可作為重要的黃瓜耐鹽篩選指標。但本試驗未對地上部與地下部干鮮重進行稱量，而發現存活率可作為一項重要指標篩選黃瓜種質的耐鹽性。這與前人的研究方法具有差異，在今后的研究中需要進一步系統性地探索更加科學可靠的耐鹽篩選指標。

4 結論

本研究通過對黃瓜材料白黃瓜、MC2065進行5個NaCl鹽濃度處理后的鹽害指數分析發現，100、150 mmol·L-1NaCl可作為黃瓜苗期耐鹽性篩選的適宜濃度。利用該濃度對21份黃瓜種質進行處理，測定株高、莖粗等形態指標，葉綠素、脯氨酸、保護酶等生理生化指標，并用聚類分析和主成分分析進行綜合評價。結果表明，萊西、壽水1、ZQ3、N26-5-1的存活率較高，表現出較強的耐鹽性，并且綜合分析得到，存活率與聚類分析和主成分分析得出的結果基本一致。各項指標主成分分析和聚類分析表明，將所有種質歸并為耐鹽、中耐鹽和鹽敏感3類，耐鹽材料、中耐鹽材料、鹽敏感材料各7個，其中耐鹽種質的排序為N26-5-1>ZQ3>20S077-1>壽水1>萊西>DRTJY-2>翠玉。