連作對獼猴桃根際土細菌群落結構的影響

趙 穎,王素玲,陳 超,奚梅杰,王曉燕,2*,江景勇,陳安東

(1臺州學院生命科學學院,臺州318000;2浙江省植物進化生態學與保護重點實驗室,臺州318000;3臺州市農業科學研究院,臺州317000;4天臺宜佳農業開發股份有限公司,臺州317200)

土壤微生物在生態系統組成和物質循環過程中扮演著重要角色,不僅通過影響土壤生態過程調節土壤環境[1],還可促進植物對礦質養分的吸收和增強植物對生物與非生物脅迫的抵抗能力[2]。土壤微生物組成和多樣性已成為指示土壤環境健康的重要指標[2-3]。隨著商業化種植面積的激增,單一作物連作不僅造成土壤自毒性增加、養分失調和產量降低等連作障礙[4],還會影響對土壤環境極為敏感的植物根際微生物群落[5-6]。

獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)落葉藤本植物,因其果實含有人體必需的17種氨基酸和礦質元素、纖維素和維生素C,且有通便和緩解腸道疾病的作用,享有“水果之王”的美譽[7-9]。作為當前果樹栽培的優先選擇,獼猴桃種植已在全世界范圍內形成了栽培面積約1.4×105hm2,產量約1.76×106t的國際化產業[10]。中國的獼猴桃栽培面積位居世界第一,分別占全球種植面積和產量的41.6%和45%[10]。然而,隨著獼猴桃連作年限的增加,常見土傳性病害(如細菌性潰瘍病、根腐病、褐斑病等)的發病率也明顯增加[10-11]。目前,連作對獼猴桃生長密切相關的根際細菌群落的影響尚不清楚。

本研究以中華獼猴桃(Actinidia chinensisPlanch.)為材料,對兩個種植基地6個連作年份梯度的獼猴桃根際土進行取樣,通過高通量測序對細菌群落結構和多樣性進行分析,以期揭示連作和土壤理化性質對獼猴桃根際土細菌群落結構的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

從浙江省臺州市天臺縣街頭鎮(120°47′56″E,29°06′43″N)兩個獼猴桃種植基地分別選擇已種植3年、4年、5年和1年、8年、12年的‘紅陽’獼猴桃種植區,形成6個種植年份梯度。每個年份梯度選擇3株健康且大小相近的獼猴桃植株,去除土壤表面雜草和落葉,用已消毒的鏟子在主根四周0—15 cm深度挖取細根,將細根上黏附的根際土抖入編號的自封袋中,放入冰盒帶回實驗室-80℃保存,用于土壤細菌群落結構分析。相同位置另取一部分土壤,室內風干后過2 mm篩,用于土壤理化性質測定,同時用土壤因子測定儀(ProCheck-GS3)在原位測定土壤電導率。

1.2 土壤微生物DNA提取

稱取約0.35 g獼猴桃根際土,用Power Soil DNA Isolation kit試劑盒(MoBio laboratories,USA)提取土壤微生物DNA。提取的DNA于1.5%瓊脂糖凝膠進行檢測,并用NanoDrop 2000(Thermo)檢測DNA濃度。6個年份梯度(每個年份梯度3個重復樣品)共提取18個樣品的DNA。

1.3 16S r RNA基因擴增及MiSeq測序

根際土細菌16SrRNA的V4—V5區采用通用引物515F/907R(F5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’,R5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)擴增。PCR擴增程序如下:94℃5 min;94℃30 s,60℃60 s,72℃90 s,34個循環;72℃10 min。PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega)定量后,委托杭州利貞生物醫藥科技有限公司用MiSeq平臺(Illumina)PE250進行高通量測序。

1.4 土壤理化性質測定

土壤pH用玻璃電極法(水土比為2.5∶1)測定。土壤有機質(Soil organic matter,SOM)含量用重鉻酸鉀法測定[12]。土壤全氮(Total nitrogen,TN)、全磷(Total phosphorus,TP)含量用高氯酸-硫酸酸溶-鉬銻抗比色法測定[12]。土壤氨態氮(Ammonia nitrogen,AN)和硝態氮(Nitrate nitrogen,NN)經氯化鉀浸提后用流動分析儀(AA3,德國BranLuebbe公司)測定其含量。土壤速效磷(Available phosphorus,AP)和速效鉀(Available potassium,AK)分別用碳酸氫鈉和乙酸銨浸提后用流動分析儀(AA3,德國BranLuebbe公司)測定其含量。

1.5 數據處理與分析

首先對測序得到的PE reads去除低質量序列和拼接;然后通過Usearch軟件平臺(version 7.1,http://drive5.com/uparse/)對優化序列提取非重復序列和去除沒有重復的單序列,再按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類,在聚類過程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列。將所有優化序列map至OTU代表序列,選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU表格。采用mothur軟件[13]利用每個樣本所含的OTU計算細菌的α多樣性:豐富度指數(ACE、Chao1)、多樣性指數(Shannon、Simpson)及測序深度指數(Coverage)。為了得到每個OTU對應的物種分類信息,通過Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html),采用RDP classifier[14](version 2.2,http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/,置信度閾值為0.7)貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并通過比對16S細菌和古菌核糖體數據庫Silva[15]分別在phylum(門)、family(科)、genus(屬)的水平上統計各樣本的群落組成。不同種植年份間共有OTU的Venn圖及非度量多維尺度(Nonmetric MultiDimensional Scaling,NMDS)分析分別用R語言的VennDiagram包[16]和vegan包[17]完成。此外,還利用Galaxy在線平臺(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)中的LEfSe(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size)篩選各種植年份具有特征意義的類群[18],LDA值設定為4.0。

采用SPSS19.0軟件對數據進行統計學分析。不同年份間OTU數、豐富度指數、多樣性指數及土壤理化性質用單因素方差分析進行比較,對不符合方差齊性的參數用非參檢驗(卡方檢驗)。多樣性指數隨連作年份變化趨勢的擬合用二次回歸。細菌多樣性指數及優勢屬與土壤理化性質之間關系的分析用Pearson相關性進行檢驗。相同門和優勢屬的多度在不同連作年份間的差異顯著性用單因素方差分析檢驗。

2 結果與分析

2.1 連作年份對土壤理化性質的影響

如表1所示,不同土壤理化性質指標隨種植年份的增加表現出不同的變化趨勢。種植1年和4年的土壤電導率SEC(Soil electrical conductivity)顯著高于其他種植年份;不同種植年份的土壤pH無顯著差異(種植4年除外),總體上呈降低趨勢;土壤有機質含量在種植5年和12年較高,顯著高于種植8年;土壤全氮(TN)含量在種植3年和4年顯著高于種植1年;種植1年的土壤氨態氮(AN)含量顯著高于種植3年和5年;土壤全磷(TP)、速效磷(AP)和速效鉀(AK)含量整體上呈現隨種植年份增加而增加的趨勢,其中種植8年和12年的土壤TP含量顯著高于其他種植年份。

表1 獼猴桃不同連作年份土壤理化性質Table 1 Soil physicochemical properties of A.chinensis in different continuous cropping years

2.2 連作年份對細菌多樣性的影響

對分別種植1年、3年、4年、5年、8年和12年的獼猴桃根際土細菌測序后發現,測序取樣覆蓋率均在99%以上,取樣深度已基本覆蓋根際土中的大部分細菌。不同種植年份OTU類型數存在差異,種植3年(3 348±93)和5年(3 279±211)的OTU類型數顯著高于種植8年(1 422±119)和12年(1 601±523)。連作時間對細菌多樣性有顯著影響,細菌豐富度指數(ACE和Chao1)及多樣性指數(Shannon和Simpson)均隨連作年份的增加呈先輕微上升后明顯下降的趨勢,其中,多樣性指數平均值在種植3—5年時較高,而隨著連作年份的繼續增加,種植8—12年時細菌多樣性指數顯著降低,二次曲線擬合均顯著(P＜0.05),對觀測數據的預測區間也呈現相同的變化趨勢(圖1)。方差分析也表明,種植3年、4年和5年的ACE、Chao1、Shannon和Simpon指數均顯著高于種植8年和12年(P＜0.05)。

圖1 細菌多樣性指數與連作年份的二次回歸Fig.1 Quadratic regression between bacterial diversity index and continuous cropping year

2.3 土壤理化性質對細菌多樣性的影響

為了探究土壤理化性質是否對細菌多樣性產生影響,對土壤理化因子與細菌多樣性指數進行Pearson相關性分析,結果表明:細菌豐富度指數ACE和Chao1與土壤AN、TP和AK含量呈顯著負相關,細菌多樣性指數Shannon與TP和AK含量呈顯著負相關,Simpson指數與TP、AP和AK含量均呈顯著正相關。而SEC、pH、SOM、TN、NN含量與細菌豐富度指數(ACE和Chao1)和多樣性指數(Shannon和Simpson)無顯著相關性?？梢?本研究中TP和AK含量會顯著改變細菌群落組成,TP和AK含量的增加顯著降低了細菌多樣性。

表2 細菌豐富度指數和多樣性指數與土壤理化性質的相關性分析Table 2 Correlation analysis between bacterial richness index and diversity index and soil physicochemical properties

2.4 連作年份對細菌群落組成的影響

獼猴桃根際土中共檢測出細菌13個門,其中優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria,占35.5%—46.3%)、酸桿菌門(Acidobacteria,占6.5%—28.6%)、放線菌門(Actinobacteria,占7.5%—18.7%)、綠彎菌門(Chloroflexi,占6.4%—9.3%)、藍藻門(Cyanobacteria,占1.72%—15.86%)和浮霉菌門(Planctomycetes,占3.79%—8.23%)(圖2)。通過對門水平上根際土細菌組成百分比進行單因數方差分析發現,變形菌門(F=18.39,P=0.013)、酸桿菌門(F=40.07,P=0.003)和浮霉菌門(F=14.42,P=0.014)在6個種植年份間存在顯著差異。其中,變形菌門(F=14.22,P=0.020)、酸桿菌門(F=39.59,P=0.003)、浮霉菌門(F=29.02,P=0.006)和厚壁菌門(Firmicutes)(F=8.06,P=0.047)在兩個種植基地間存在顯著差異。

對根際土中檢測到的相對豐度＞5%的細菌屬繪制柱狀圖(圖2)發現,不同種植年份的獼猴桃根際土細菌群落優勢屬存在差異:種植1年的獼猴桃根際土中羅河桿菌屬(Rhodanobacter)和水恒桿菌屬(Mizugakiibacter)為優勢菌屬;種植3—5年的根際土中Acidobacteriaceae_Subgroup_1_uncultured、Acidobacteria_norank和Cyanobacteria_norank為優勢菌屬;而種植8年和12年的根際土中Xanthomonadales_uncultured、Cyanobacteria_norank、酸桿菌屬(Acidibacter)和水恒桿菌屬為優勢菌屬。此外,隨著連作年份增加,Cyanobacteria_norank(F=18.40,P=0.013)和Xanthomonadales_uncultured(F=17.65,P=0.014)的豐富度指數與年份呈顯著線性相關。其中,種植12年(13.08%)的獼猴桃根際土中植物病原菌Xanthomonadales_uncultured所占比例分別是種植1年(1.17%)、3年(0.88%)、4年(1.35%)、5年(1.16%)和8年(12.06%)的11.2倍、14.9倍、9.7倍、11.3倍和1.1倍。對兩個種植基地的優勢屬相對豐度比較發現,Acidobacteriaceae_Subgroup_1_uncultured(F=787.42,P＜0.001)、Acidobacteria_norank(F=12.54,P=0.024)和水恒桿菌屬(F=24.01,P=0.008)3個屬在兩個種植基地間存在顯著差異。

圖2 細菌群落結構的門分布(左)和優勢屬(右)Fig.2 Phylum distribution(left)and dominant genus(right)of bacterial community structure

利用種植1年、3年、5年、8年和12年的細菌OTU分布繪制Venn圖發現,15個樣品共有OTU數1 183個(圖3)。根際土細菌特有OTU數隨種植年份的增加逐漸較少,依次為1年(291)＞5年(196)＞3年(158)＞8年(100)＞12年(96)。

圖3 不同連作年份根際土細菌OTU分布Venn圖Fig.3 Venn diagram of bacteria OTU distribution in rhizosphere soil in different continuous cropping years

2.5 連作年份和土壤理化性質對細菌優勢門和優勢屬的影響

對優勢門和相對豐度＞5%的優勢屬與連作年份和土壤理化性質進行Pearson相關性分析發現,相對豐度最高的變形菌門與年份無相關性,而該門的Xanthomonadales_uncultured、酸桿菌屬和水恒桿菌屬與年份、AN、TP、AP及AK含量中至少一個指標呈顯著正相關,該門的羅河桿菌屬與SEC和AN含量呈顯著正相關。酸桿菌門及該門的2個屬Acidobacteriaceae_Subgroup_1_uncultured和Acidobacteria_norank趨勢相同,與年份、AN、TP、AP及AK含量中的大部分指標呈負相關。藍細菌門及該門的Cyanobacteria_norank均與年份、TP、AP及AK含量呈極顯著正相關。各優勢門和屬與土壤pH、SOM及TN含量沒有顯著相關性。

表3 細菌優勢門和優勢屬與土壤理化性質的相關性分析Table 3 Correlation analysis between dominant phyla and genus of bacteria and soil physicochemical properties

2.6 連作年份和土壤理化性質對細菌群落結構的影響

對不同連作年份根際土細菌群落進行NMDS分析發現(圖4),種植1年和8年的細菌群落置信區間只與種植12年有部分重疊,與其他種植年份均相距較遠;種植3年、4年和5年的細菌群落置信區間相距較近,說明3年、4年和5年的細菌群落相似度較高。這與采樣位置相符合,種植3年、4年和5年為同一個種植基地,種植1年、8年和12年為另一個種植基地。對種植年份和土壤理化性質對細菌群落結構的影響分析也表明,采樣位置(r2=0.37,P=0.034)、年份(r2=0.34,P=0.044)、AN含量(r2=0.41,P=0.020)和AK含量(r2=0.46,P=0.007)對細菌群落結構有顯著影響,TP含量對細菌群落結構的影響達到臨界顯著(r2=0.28,P=0.088),其他土壤理化性質對細菌群落結構沒有顯著影響。

圖4 不同連作年份根際土細菌群落的非度量多維尺度(NMDS)分析Fig.4 Non metric multidimensional scale(NMDS)analysis of bacterial community in rhizosphere soil in different continuous cropping years

2.7 不同連作年份間具有顯著性差異的細菌群落標志物

鑒于某類群在不同連作年份間分布差異顯著并不能代表該類群具有特征意義,進一步利用LEfSe篩選各連作年份具有特征意義的類群。結果發現:種植1年的根際土中,放線菌門的Frankiales目、厚壁菌門(Firmicutes)的梭菌綱(Clostridia)、變形菌門的產堿菌科(Alcaligenaceae)和黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)的羅河桿菌屬為生物標記類群;連作3年的土壤中,α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的根瘤菌目(Rhizobiales)為生物標記類群;連作4年的土壤中,酸桿菌門的Acidobacteriacea_Subgroup_g_uncultured屬、浮霉菌門的浮霉菌科(Planctomycetaceae)、α-變形菌綱的醋桿菌科(Acetobacteraceae)為生物標記類群;連作5年的土壤中,酸桿菌門的3個屬Acidobacteria_g_norank、Candidatus_Solibacter和Bryobacter屬和變形菌門的δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)為生物標記類群;連作8年的土壤中,變形菌門γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的水恒桿菌屬和酸桿菌屬為生物標記類群;連作12年的土壤中,藍細菌門的Cyanobacteria_g_norank屬和變形菌門 γ-變形菌綱Xanthomonadales_f_uncultured目的Xanthomonadales_g_uncultured科為生物標記類群(圖5)。

圖5 不同連作年份差異細菌類群進化分類等級圖Fig.5 Evolutionary classification of different bacterial groups in different continuous cropping years

3 討論

近年來,隨著獼猴桃栽培面積的擴大,由連作和種苗傳播導致的土傳病害已成為制約獼猴桃產業發展的主要因素[11]。目前研究主要集中于對獼猴桃病害的記錄和描述以及病害的防治,從土壤微生物角度分析連作對根際細菌群落的影響未見報道。

本研究從獼猴桃根際土中共檢測到13個細菌門,優勢門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和藍細菌門。其中,變形菌門(35.50%—46.32%)相對豐度最高,這與連作對枸杞[19]、棉花[20]的根際土細菌群落多樣性的影響類似。對全世界6個洲237份土樣中細菌群落的分析也發現,變形菌門、酸桿菌門和放線菌門是相對豐度最高的3個門,但不同環境條件下各菌門相對豐度的順序會變化[21]。本研究中,藍細菌門也是優勢菌門,且與連作年份、土壤全磷、速效磷和速效鉀含量存在極顯著正相關。對蓮霧(Syzygium samarangense)根際細菌多樣性的研究也發現,優勢菌門順序與世界總體情況不同,依次為酸桿菌門、綠彎菌門、變形菌門和放線菌門[22]。

果園連作障礙不僅表現為果樹生長受抑和果實品質下降,還會引起根際土壤微生態系統失調和土壤微生物多樣性降低[4,23-25]。本研究通過比較不同連作年份間獼猴桃根際細菌群落發現,細菌OTU數、特有OTU數、豐富度指數(ACE和Chao1指數)和多樣性指數(Shannon和Simpon指數)均隨連作年份的增加而降低,NMDS分析也表明連作年份對細菌群落組成有顯著影響,這與西瓜[26]、馬鈴薯(Solanum tuberosum)[27]根際細菌群落的研究類似。

連作會通過多種途徑影響土壤細菌群落,其中土壤理化性質的變化是連作帶來的普遍問題[28]。土壤是根際細菌生存的主要環境,土壤理化性質的變化顯著影響微生物群落結構[28-29]。研究發現,長期連作會破壞土壤結構和造成養分失衡[24]。有關刺槐(Robinia pseudoacacia)根系分泌物對根際細菌影響的研究表明,刺槐根際土壤理化性質的改變增加了根際土壤堿解氮、AP和有機質含量,從而增強了變形菌門和放線菌門部分細菌對土壤資源的競爭,最后導致酸桿菌門和硝化螺旋菌門細菌的減少及根際土壤細菌多樣性的降低[30]。

同種作物連續種植導致的土壤特定養分的積累或不足也會改變土壤理化性質。對棉花不同連作年份土壤理化性質比較發現,土壤AP和AK含量均隨連作年份的增加而減少[29]。而本研究發現,隨著連作年份的增加,土壤AN、TP、AP和AK含量增加。這一方面可能與獼猴桃種植過程中持續施肥,而獼猴桃本身對養分的吸收能力有限導致的養分積累有關;另一方面可能與連作引起的土壤微生物群落的變化有關。本研究中,土壤AN、TP和AK含量與細菌豐富度指數ACE和Chao1及多樣性指數Shannon呈顯著負相關,說明土壤AN、TP和AK含量的增加會顯著降低細菌多樣性。此外,土壤理化性質還會顯著影響優勢門和優勢屬的相對豐度。在13個優勢門和優勢屬中有11個相對豐度與至少一個土壤理化性質有顯著相關性,說明大部分的優勢細菌類群對土壤養分較為敏感。但是同一個門的不同細菌類群對土壤理化性質的響應也可能不同,如變形菌門的Xanthomonadales_uncultured、Acidobacteria和水恒桿菌屬與土壤AN、TP、AP及AK含量中至少一個指標呈顯著正相關,而該門的羅河桿菌屬則與以上指標呈負相關,與土壤電導率SEC和AN呈顯著正相關。羅河桿菌屬與土壤氮的固定或轉換有關,尤其偏好化學氮肥[31]。本研究表明,該屬偏好很可能傾向于AN。而酸桿菌門及該門的2個屬Acidobacteriaceae_Subgroup_1_uncultured和Acidobacteria_norank與羅河桿菌屬對土壤養分的響應不同,與AN和AK含量呈顯著負相關,說明酸桿菌可能更偏好養分貧瘠的土壤。藍細菌門則會在養分豐富的土壤中積累,與AN、TP、AP及AK含量呈極顯著正相關。

在分析過程中,還發現種植地點對細菌群落組成也有顯著影響。第一個基地(種植1年、8年、12年)中變形菌門和厚壁菌門顯著高于第二個基地(種植3年、4年和5年),而酸桿菌門和浮霉菌門顯著低于第二個基地。對兩個種植基地的優勢屬相對豐度比較發現,Acidobacteriaceae_Subgroup_1_uncultured和Acidobacteria_norank顯著低于第二個基地,而水恒桿菌屬顯著高于第二個基地。這可能與不同基地的管理方式有關,即不同的基地對于土壤的施肥、殺菌、除草等的實施方式、種類和劑量不同。土地種植方式、水分、施肥等管理以及土壤環境狀況對微生物數量、活性與種群結構有著較大影響。土地種植方式不同,土壤微生物數量和種群結構及其多樣性必然會存在某種程度的差別[32]。如不同施肥處理導致稻田土壤微生物群落結構和多樣性差異明顯[33]。土壤養分也能很好地預測微生物生物標記或豐度[34]。Wallis等[1]研究發現,土壤條件(包括AP、Mg2+、總陽離子、K和SOM含量)與土壤細菌群落結構和組成顯著相關。種植方式會顯著改變微生物群落結構和功能[35]。

根際是植物根系與土壤微生物間互作的獨特環境。研究發現,根際微生物對植物生長和養分吸收存在正的或負的影響,其中益生菌能提高植物抗性、固氮、解磷等功能,而致病菌會阻礙植物生長[36]。連作會導致土壤中有益微生物減少和土傳性有害微生物增加[37-38]。對大蒜(Allium sativumL.)連作條件下根際土壤微生物的研究表明,長期連作會抑制有益微生物的生長[39]。對花生(Arachis hypogaeaL.)[40]和番茄(Solanum lycopersicum)[41]的研究也證實,連作時間的增加會導致根際土中假單胞菌(Pseudomonasspp.)及芽孢桿菌(Bacillusspp.)等有益微生物數量減少,從而減弱對有害微生物的拮抗作用及土傳病害積累。本研究中,隨著連作年份的增加,獼猴桃根際土中的放線菌和芽孢桿菌數量無明顯變化。但是,在種植8年和12年的根際土中黃單胞菌Xanthomonadales_uncultured屬顯著增加,該屬為植物致病菌,在侵入植物后會降解植物薄壁細胞,獲取營養,使植物患病[42]。研究表明,黃單胞屬(Xanthomonas)能夠引起小麥(Triticum aestivumL.)和棉花等糧食作物和經濟作物減產[43]。此外,野油菜黃單胞菌(X.campestrispv.campestris)能致所有十字花科植物患黑腐病[44]。采樣過程中,只有種植8年和12年的獼猴桃出現了潰瘍病。在實際生產中也發現,獼猴桃連作時間超過4—5年時,容易患病,且引起不同程度的死亡。獼猴桃感病是一個復雜和多因素決定的過程,雖然獼猴桃患病與黃單胞菌的關系目前還不清楚,但是土壤中致病菌的積累可能是重要原因之一。

4 結論

長期連作嚴重影響了獼猴桃根際土中的細菌群落結構,不僅改變了土壤理化性質,增加了土壤養分的積累,還通過影響土壤理化性質降低了細菌多樣性和特有類群的數量。其中連作年份、種植地點、氨態氮和速效鉀含量對細菌群落結構產生了顯著影響。進一步分析發現,大部分細菌優勢門和優勢屬均與一個或幾個土壤理化性質呈顯著相關,且不同門和屬對土壤理化性質的偏好不同,甚至相反。其中部分對植物有害的類群隨連作年份增加呈顯著增加的趨勢。因此,獼猴桃連作過程中應根據特定品種對不同養分的需求和土壤中養分的含量采取適當的施肥措施。