RNAi生物農藥在作物保護上的應用

莫 芹,徐莉莉,呂貝貝*

(1上海市農業科學院生物技術研究所,上海 201106;2上海市農業遺傳育種重點實驗室,上海 201106;3上海市農業技術推廣服務中心,上海 201799)

為了應對全球環境變化和病蟲侵害給農作物生產和糧食安全帶來的挑戰,現代農業生物技術在保證農作物產量、品質等方面起了重要的作用。在這些技術中,RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術被認為是農業綠色防控中最具有應用潛力的生物技術之一[1-3]。該技術具有高效性、特異性和可傳播性等特點,通過特定的設計,由植物表達或其他方式制備獲得的RNAi生物農藥可以高特異性地抑制危害植物的真核微生物或無脊椎動物關鍵基因表達,從而達到控制病蟲害的效果[4]。

目前RNAi技術已經被廣泛應用于植物發育、種質改良和病蟲害防控等方面[5]?；赗NAi開發的生物農藥可以預期以轉化和非轉化產品形式進入市場。轉化形式的第一個產品是美國孟山都公司研發的抗蟲轉基因玉米SmartStax?PRO品種,已經于2017年在美國和加拿大相繼獲得了商業化種植的許可[6]。非轉化形式的產品可以通過噴灑、莖注射、蘸根、種子處理等形式進行RNA制劑的局部施用。盡管目前沒有此類形式的產品上市,但隨著真核生物RNAi機制的逐步解析,生產成本及功效進一步改善,此類新型生物農藥也將在害蟲防治領域發揮越來越重要的作用。與傳統化學農藥相比,該技術是一種通用的、環境友好的農業病蟲害防控策略。此外,該技術結合其他育種技術和生物農藥技術,能夠減少農業對于化學合成農藥的依賴,為未來農業的可持續發展保駕護航[2]。

1 RNA干擾技術

1.1 RNAi簡介

RNAi是指通過雙鏈(dsRNA)或發夾RNA(hairpin RNA,hpRNA)誘導的真核生物同源mRNA降解,從而下調基因表達的生物學現象[7]。RNAi作為一種轉錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS)機制,是一種真核生物中普遍存在的古老的基因表達調控機制,參與了宿主對病毒的防御,對染色體和基因組完整性的維護等重要的生物學過程[8]。該機制的觸發因子是由外源或者內源產生的雙鏈RNA(dsRNA),通過dsRNA誘導使同源mRNA發生高效特異性的降解,從而達到序列特異性的轉錄后基因沉默效果。這種觸發因子可能由基因組自身因為反向互補結構產生,也可能是因外源微生物(如病毒)入侵導入的,因此RNAi也是生物體抵抗外界生物侵染,保護自身遺傳物質穩定的天然免疫模式[9-10]。

利用RNAi技術可以特異性地下調特定基因的表達,該方法相對于基因編輯技術來說易于實現、操作簡便,特異性高,因此它是真核生物遺傳學、功能基因組學等研究的有效工具,目前已經應用于動植物基因功能的探索、植物病蟲害防治、流行病和基因治療等研究領域[11-13]。

1.2 RNAi的放大效應

大量的mRNA轉錄后降解是真核細胞基因轉錄后調控的重要手段,RNAi機制最終結果也是導致mRNA的降解,從而在轉錄后水平上沉默基因的表達。轉錄后mRNA自然降解和RNAi的主要區別是RNAi過程中形成的初級小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)能夠造成下一輪的mRNA降解,從而形成逐級放大的循環效果[14]?；趯δＪ街参飻M南芥的研究,科學家們總結了植物RNAi循環機制,示意圖如圖1所示[15-16]。植物中的ARGONAUTE(AGO)蛋白家族(擬南芥中主要為AGO1和AGO2)能夠以mRNA為靶標,在初級siRNA或microRNA的序列互補引導下進行切割;接著RNA依賴型的RNA聚合酶6(RNA-dependent RNA polymerase 6,RDRP 6)識別切割后的mRNA并產生雙鏈RNA(dsRNA);產生的dsRNA被DICER-LIKE家族蛋白DCL2和DCL4切割成次級siRNA;最后,次級siRNA又可以進入AGO1,并針對額外的mRNA進行切割,導致其RNAi形成循環機制,從而放大轉錄后基因沉默的效果。在線蟲、真菌和植物中存在基于RDRP的信號放大途徑[17-18]。由Dicer剪切后的siRNA在RDRP的作用下能夠以siRNA反義鏈為引物,以靶mRNA作為模板合成新的dsRNA,再次加入到RNAi通路從而逐級放大基因沉默效果。因此在這些生物體內只需要很少的siRNA即可以引發RNAi效應。

圖1 植物RNAi機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of RNAi machinery in plants

2 植物中RNA干擾的作用機制

植物中存在大量的小RNA分子,它們在植物基因的調控、轉座子的防御,以及病毒活性的控制等方面具有重要作用。這些小RNA分子主要由4種途徑產生:微小RNA途徑、反式作用小干擾RNA途徑、RNA介導的DNA甲基化途徑,以及由外源核酸誘導的RNA沉默途徑,這4種途徑有部分重疊但功能分明[19]。前三種途徑的小RNA分子均來源于宿主本身,與宿主代謝調節和維持遺傳物質穩定性相關,第四種外源核酸分子來源包括病毒和轉基因,與植物抗病毒免疫途徑相關。RNAi技術用于病蟲害防治的主要機理是基于第四種途徑進行設計的,因此這里主要討論抗病毒RNAi和正義轉基因誘導的RNAi兩方面的機制研究。RNAi的觸發因子是dsRNA,已有研究表明,病毒的RNA基因組或轉錄本復制導致了dsRNA的產生,這在RNAi機制中發揮了重要作用[20]。入侵的核酸分子還包括由含有表達盒的轉基因作物產生的dsRNA。事實上大多數我們所了解的內源siRNA途徑也是來自于以正義轉基因和病毒為模型的研究[19]。

2.1 抗病毒RNAi

RNAi已經被認為是植物的一種天然抗病毒防御機制。任何類型的病毒或亞病毒因子感染植物都與病毒小RNA分子的積累有關,這些RNA是從病毒雙鏈RNA加工而來,并使用相同的宿主植物siRNA生物合成機制,利用AGO蛋白指導降解單鏈病毒RNA。因此病毒既是siRNA途徑的誘發劑又是靶標。

來源于RNA病毒的siRNA主要被DCL4蛋白加工,也有部分被DCL2蛋白加工,最終生成的siRNA大小以21nt為主,也有部分為22 nt[21]。在正鏈和負鏈病毒基因組RNA之間形成的dsRNA,以及在單鏈病毒基因組RNA內形成的莖環結構,都被認為是病毒siRNA的前體[22]。對于DNA病毒來說,基因組復制和RNA轉錄發生在宿主植物細胞的細胞核內,因此細胞核的DCL3蛋白也參與處理DNA病毒產生siRNA(大小為24 nt)的過程。這些24 nt的病毒siRNA可以引導RdDM到DNA病毒基因組,導致病毒基因啟動子的DNA甲基化以及病毒基因的轉錄基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)[23]。因此包括RNAi的PTGS途徑和TGS途徑都參與到植物抵抗DNA病毒的過程。

2.2 正義轉基因誘導的RNAi

正義轉基因的RNAi需要植物中RDRP6、DCL4、SGS3和AGO1等蛋白參與其傳遞性和系統性兩個方面,都涉及主要靶基因以外區域21 nt siRNA的產生,這說明次級siRNA是PTGS途徑的重要成分。來自于轉基因的異常RNA轉錄本是PTGS途徑的有效觸發因子,植物基因組上的多拷貝、含有倒置重復序列的基因片段在讀碼轉錄后可以產生發夾結構的RNA(hpRNA)。由這些初級dsRNA或hpRNA加工而成的siRNA要么本身就能誘導出完整的RNAi,要么更有可能觸發次級siRNA的產生,從而導致全面的RNAi[24]?？傊?dsRNA/hpRNA經過植物的RNAi機制產生的小RNA分子(包括miRNA和siRNA),它們能夠在轉錄后水平和轉錄水平兩方面起調控基因表達的作用,但其中的詳細機制目前尚不能明確區分。

3 RNA干擾技術在作物保護上的應用形式

根據dsRNA的來源不同,RNAi在農業上的應用主要有3種表現形式:第1種是以宿主表達的dsRNA誘導基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)。病原微生物或害蟲在侵染作物時,會攝入宿主表達的靶標dsRNA分子,從而干擾了病原微生物或害蟲的關鍵靶標基因的表達,影響其生長發育,進而達到防治效果。第2種是以病毒或者細菌等微生物載體表達的dsRNA誘導的基因沉默(Vector-mediated gene silencing,VMGS)。該方法通常選用中性病毒載體或者植物內生菌作為dsRNA的表達和運送載體。第3種是外源dsRNA誘導的基因沉默(Exogenous dsRNA-induced gene silencing,EdIGS)。EdIGS與傳統農藥的使用方法最為相似,但dsRNA分子的穩定性是該技術能否有效的關鍵。三種形式的dsRNA傳遞形式不同,其應用效果也存在不同的優缺點(表1)。

表1 3種RNAi表現形式優缺點比較Table 1 Advantages and drawbacks of three RNAi performances

3.1 HIGS

傳統的病蟲害抗性品系的篩選需要花費大量的人力和時間,而且篩選效率低。為了克服抗性品種的局限性,HIGS作為現代生物育種技術之一,被廣泛應用于生產抗各種病蟲害的作物。迄今為止,已經發表了170多項HIGS研究,相應的產品也已經推出[25],如抗病毒和病原真菌的香蕉品種、抗條銹病的轉基因小麥品種以及第三代具有根蟲抗性性狀的玉米品種MON 87411等[6,26-27]。

通過轉基因的途徑實現RNAi應用的研究較早,該方法需要制備dsRNA/hpRNA結構,并生成穩定遺傳的轉基因植株品系,能夠持續合成RNAi的誘發因子,因此能夠獲得持續的病蟲害抗性,種植生產時不需要額外的病蟲害管理。HIGS技術是植物病害防控中最有前景的轉基因技術之一,通常是針對效應子基因或者關鍵管家基因的沉默,目前在病毒和谷物枯萎病防治方面已有大量研究報道[28-30]。然而,基于HIGS技術抗性轉基因植株的獲得高度依賴于目標作物的可轉化性和遺傳穩定性,通常需要很長的時間。此外,盡管科學證明長dsRNA不會導致飲食危險,消費者對轉基因作物和產品的接受度仍然限制了該方法的發展[31]。目前在我國可以種植的RNAi作物只有轉基因木瓜,它是采用HIGS技術將木瓜環斑病毒的基因導入到木瓜中,用來防控嚴重影響木瓜產量的環斑病毒,目前市面上90%的木瓜均是以這種技術保障其產量的[32]。

3.2 VMGS

鑒于跨系統RNAi(trans-kingdom RNAi)途徑能夠使RNAi在微生物組或者微生物個體和宿主之間轉移,利用病毒或者內生菌載體的策略被認為是一種折中可行的RNAi傳遞方式[33]。利用病毒載體在植物中表達異源基因是實驗室中的常規操作,但這些載體通常只能用于短期實驗或者生產一些特殊的產品。開發常年存在于植物中的病毒載體能夠在植物中持續穩定地表達異源基因。結合構建含有RNAi靶序列的病毒載體的方法,能夠幫助實現植物病害防治的田間應用,例如對于柑橘毀滅性病害——黃龍病的治理。柑橘黃龍病是公認的難治病害,由亞洲韌皮桿菌侵染所引起的,其傳播載體是亞洲柑橘木虱。研究學者通過在韌皮部接種含有亞洲柑橘木虱部分異常翼盤基因(Asd)的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),能夠有效控制病菌傳播載體(亞洲柑橘木虱)的數量,從而進一步有效控制柑橘黃龍病的傳播[34]。

利用細菌載體傳遞dsRNA/hpRNA在模式昆蟲和哺乳動物的基因功能研究中已有先例。RNAi的發現之初,Fire等[35]就發現表達dsRNA的大腸桿菌可以對以其為食的線蟲幼蟲產生特定的干擾作用。在線蟲的基因功能研究中相對于顯微注射、浸泡、轉基因植物等dsRNA傳遞方式,通過喂食表達dsRNA的大腸桿菌的方式具有簡便、成本低、可操作性強等優點,目前利用非病原細菌傳遞RNAi已經成為取食性昆蟲基因功能研究的重要手段之一[36]。利用細菌工程菌/病毒載體的RNAi生物農藥,也可以作為一種選擇性、環保型殺菌劑,用于植物病蟲害的防治。研究表明,通過飼喂表達特定靶標基因dsRNA的大腸桿菌能夠防控多種害蟲的危害,例如給鱗翅目害蟲甜菜夜蛾和東方粘蟲飼喂表達幾丁質合成酶基因(SeCHSA)dsRNA的大腸桿菌,會干擾其幼蟲的生長發育,導致其致死[37-38]。危害全球楊柳科植物的鞘翅目害蟲柳藍葉甲通過大腸桿菌介導的RNAi也能得到有效的防控[39]。

3.3 EdIGS

由這種形式開發的生物農藥與傳統農藥類似,主要以非轉化形式(噴施、莖注射、蘸根、種子包衣劑等)的產品上市。該方法以非轉基因方式激發植物的RNAi機制,能夠獲得政府監管和消費者的認可。目前為止,dsRNA的外源性應用已經有效地觸發了植物基因、病毒、真菌、昆蟲和螨蟲的RNAi,在植物保護和生物育種等方面具有廣泛的應用范圍和開發潛力[40]。植物中SIGS的影響因素主要包括4種:dsRNA的質量(包括長度和濃度)、施用方法、傳遞方法和植物器官的敏感度[41]。實驗證明,外源應用22 nt siRNA是植物中局部和全身性RNAi最有效的誘導劑。將RNA分子結合到納米粒子和載體肽中,極大地提高了它們對核酸酶的抗性和傳遞效率[42]。高壓噴霧可使外源RNA共質體傳遞,而葉柄吸收和/或主干注射則導致外源RNA外質體傳遞[43-44]。以上施用和傳遞技術已經在實驗室中取得成功,但也應該注意到高新技術的成本問題。綜合來看SIGS方式在農業大田應用中的主要挑戰是dsRNA的合成成本和dsRNA的穩定性問題。通過工程微生物表達dsRNA的方式能夠一定程度上降低dsRNA合成成本[45-47]。隨著市場對dsRNA的興趣不斷增長,推動了更好的生產系統、高效配方的發展,并將其成本從2008年的每克12 500美元降至2017年9月的每克近2美元。雖然還缺乏實地試驗,但dsRNA的需求量預計為2—10 g/hm2[48]。

4 總結與展望

為了應對全球環境變化和人口增長的壓力,糧食安全問題迫切需要新的可持續的技術保駕護航。在農業綠色防控領域,RNAi技術被認為是一項公認的具有前景的作物病蟲害防治工具。該技術主要以HIGS、VMGS和EdIGS三種形式應用,目前在病毒、真菌、昆蟲、線蟲等多種病蟲害防治中均有應用研究。其中以HIGS策略開發的轉基因產品被認為是繼Bt技術后的第三代抗蟲生物農藥,它能夠緩解昆蟲抗藥性壓力,延長以基于Bt蛋白技術的轉基因農作物的使用壽命。

以HIGS形式的RNAi目前已有產品應用,但該產品通過轉基因植物的方式上市,因此政府監管部門和社會對其施加了一定的壓力,建立配套推廣的安全性評價體系刻不容緩[49-50]。而以VMGS和EdIGS形式開發的產品目前仍然在基礎研究階段,這兩種應用形式的基礎機制仍然有很多未得到清晰的解析,比如涉及靶標和宿主之前的跨界RNAi(cross-kindom RNAi)機制,這也是限制其應用的主要因素之一[51]。同時,為了實現基于RNAi生物農藥在農作物保護上的推廣與田間應用,我們也需要進一步了解RNAi的分子機制(包括宿主和靶標RNAi機制的貢獻和特異性,以及RNAi觸發分子的攝取和轉運等),從而合理評估該技術未來田間應用的穩定性、特異性、持久性以及相應的可能性風險。