豬源嗜酸乳桿菌La-0231分離鑒定及其特性分析

宋士良

（上海邦成生物工程有限公司，上海 201506）

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，1900年首先從嬰兒糞便中分離出來，當時被命名為嗜酸芽孢桿菌(Bacillus acidophilus)。1970年經Hanson和Moquot重新鑒定、分類后，修改為現在的名稱，屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌（Widyastuti等，2014）[1]。嗜酸乳桿菌是少數可以存活并定植于人或動物腸道內的益生菌之一，其在腸道內的定植能力強于其它微生物。它能競爭性地定植于小腸上皮細胞，產生細菌素和有機酸，維持腸道內低pH環境，促進腸道中微生態環境的正?；⊿capin等，2013）[2]。嗜酸乳桿菌作為動物腸道中重要的益生菌，具有維護動物腸道健康、緩解不良應激、改善飼養環境、調節機體脂肪代謝和改善畜禽產品品質等功能（胡國才等，2013）[3]。La-0231菌株分離自仔豬新鮮糞便，經16SrDNA測序及生理生化特性鑒定確認其為嗜酸乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 分離源仔豬新鮮糞便。

1.1.2 分離培養基MRS（含溴甲酚紫）固體培養基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸粉5g，檸檬酸氫二銨2g，K2HPO42g，NaAc·3H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐溫80 1mL，蒸餾水定容1000mL，瓊脂20g，pH6.0～6.5，0.6%溴甲酚紫1mL。

1.1.3 牛奶管保種培養基脫脂奶粉10g，酵母膏2g，葡萄糖1g，蒸餾水100mL。

1.1.4 鑒定培養基MRS固體培養基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，檸檬酸氫二銨2g，K2HPO42g，NaAc·3H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐溫80 1mL，蒸餾水定容1000mL，瓊脂20g（MRS液體培養基不加瓊脂），pH6.0～6.5。

1.1.5 細菌生化鑒定管 苦杏仁苷、水楊苷、七葉靈、纖維二糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖、接觸酶等的細菌生化鑒定管。

1.1.6 定量抗生素紙片標準品 實驗用定量抗生素紙片標準品，由中國食品藥品檢定研究院出品。

1.1.7 實驗動物 選用健康成年ICR小鼠80只，雌雄各半，雌性小鼠體重范圍17.92g～21.89g，雄性小鼠體重范圍19.20g～22.79g。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化步驟

①將采集的仔豬新鮮糞便逐級稀釋，取0.1mL稀釋液涂布于MRS（含溴甲酚紫）固體培養基平板（下同）上，37℃兼性厭氧培養2d。

②將培養好的平板取出，選取所有菌落形態為黃色、表面濕潤、平凸、邊緣整齊、大小在0.5mm～2.5mm的單菌落，對應作標記，在無菌條件下挑取作記號的菌落，革蘭氏染色，保留鏡檢形態為桿菌、兩端圓、大小通常為0.6μm×1.5μm～0.9μm×6.0μm，以單個、成雙或短鏈出現的單菌落，并將平板上保留的單菌落標記為嗜酸乳桿菌疑似菌株。

③將疑似菌株采用劃線的方式轉接到空白平板上，37℃，兼性厭氧培養2d，進行初步的菌株純化。

④選取上述相同菌落形態的單菌落，再劃線轉接到空白平板上，37℃兼性厭氧培養2d，進一步對菌株進行純化。反復多次，直至鏡檢無雜菌。

⑤選取上述相同菌落形態的單菌落，轉接到保種牛奶管中，37℃兼性厭氧培養15h，2℃～4℃冰箱冷藏保存備用。

1.2.2 菌種鑒定

①生理生化特性鑒定。采用細菌生化鑒定管法測定。

②16SrDNA測序。分離、純化菌種，委托上海美吉生物醫學科技有限公司進行測序，經16SrDNA基因作為Marker片段，通用引物擴增出基因中16SrDNA序列，再進行電泳檢測，使用3730XL測序儀進行一代雙末端測序，獲得abi測序峰圖文件，通過軟件組裝后，與NT數據庫進行比對，獲得近源物信息。

1.2.3 抗生素敏感試驗 采用K-B法測定。

1.2.4 菌株毒力試驗

①培養物制備。將嗜酸乳桿菌La-0231菌株轉接至MRS固體培養基上，37℃兼性厭氧培養48h；挑取單菌落轉接至MRS液體培養基中，37℃兼性厭氧培養48h后，將部分培養液常溫下濃縮5倍備用，其余直接供實驗用。

②活菌計數。無菌吸取上述①中培養液1mL，加入9mL無菌生理鹽水稀釋液中混勻，并進行10倍梯度稀釋，選擇合適的2～3個稀釋度，吸取0.1mL稀釋液分別涂布于MRS固體培養基平板上，每個稀釋度2塊平板，置37℃，兼性厭氧培養48h，計數。

③小鼠毒力試驗。小鼠80只，雌雄各半，分別隨機分為4組。劑量組設置為：培養基空白對照組、培養基5倍濃縮空白對照組、培養物原液組、培養物5倍濃縮組。將受試物以0.02mL/g體重的劑量給小鼠灌胃，連續灌服3d，觀察7d，記錄實驗過程中小鼠的中毒表現或死亡情況。

1.3 試驗數據統計

以下試驗數據均為2次重復的平均值，數據經過Excel 2016處理后，定量測定數據利用SPSS 21.0統計軟件進行方差分析，差異顯著時采用Duncan’s法進行多重比較，試驗結果以“平均值±標準差（±s）”表示，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株分離鑒定

2.1.1 菌株分離純化

試驗采用仔豬新鮮糞便，逐級稀釋涂布平板培養，從菌落形態、菌體顯微形態、革蘭氏染色著手挑取單菌落，再經反復多次劃線分離菌種，獲得純化菌株。該純化菌株菌落形態、菌體顯微形態和革蘭氏染色特征見圖1。

圖1 純化菌株菌落形態、菌體顯微形態和革蘭氏染色特征

2.1.2 生理生化特性鑒定結果

采用劃線的接種方式，將牛奶管中保存的菌種，轉接到MRS固體培養基平板上，37℃兼性厭氧培養2d，進行菌種純化。挑取培養好的單菌落，轉接到MRS固體培養基平板上，37℃兼性厭氧培養2d，收集培養好的菌苔，進行菌種的細菌生化管鑒定。鑒定結果見表1。

表1 嗜酸乳桿菌La-0231菌株細菌生化管鑒定結果

從表1的檢測結果可以看出，La-0231菌株能利用葡萄糖產乳酸；接觸酶陰性；能在pH4.5，15℃～45℃溫度環境下，厭氧或好氧生長；能發酵牛奶產酸凝固；能利用苦杏仁苷、水楊苷、七葉靈、纖維二糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖等碳水化合物產生乳酸。生理生化特性鑒定為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。

2.1.3 16SrDNA測序結果

采用劃線的接種方式，將牛奶管中保存的菌種，轉接到MRS固體培養基平板上，37℃兼性厭氧培養2d，進行菌種純化。挑取培養好的單菌落，轉接到MRS固體培養基平板上，37℃兼性厭氧培養2d。分離、純化好的菌種，經16SrDNA基因作為Marker片段，通用引物擴增出基因中16SrDNA序列，獲得其特征序列圖，見圖2。

從圖2的測序結果可以看出，La-0231菌株其16SrDNA序列為1460bp，與嗜酸乳桿菌模式菌株KLDS 1.0701進行比對，其16SrDNA基因序列相似性達99.86%，鑒定結果為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。

圖2 嗜酸乳桿菌La-0231菌株16Sr DNA特征序列

2.2 菌株特性分析

2.2.1 抗生素敏感性測試結果

采用K-B法，測定嗜酸乳桿菌La-0231菌株對30種抗生素的敏感性。檢測結果見表2。

表2 嗜酸乳桿菌La-0231菌株對30種抗生素的敏感性測試結果

從表2的測試結果可以看出，嗜酸乳桿菌La-0231菌株對青霉素、羧芐青霉素、四環素、慶大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、鏈霉素、強力霉素、克拉霉素、氯霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、呋喃妥因、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、復方新諾明敏感；對環丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感；對氟羅沙星、洛美沙星、諾氟沙星不敏感。

2.2.2 菌株毒力測試結果

①培養物原液中活菌計數結果

將嗜酸乳桿菌La-0231菌株轉接至MRS液體培養基中，37℃兼性厭氧培養48h后，對培養物原液進行10倍梯度稀釋，平板計數，結果見表3。

表3 嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養物原液中活菌計數結果

從表3的檢測結果可以看出，培養物中的活菌數為2.65×108CFU/mL或2.70×108CFU/mL，兩個稀釋度檢測結果無顯著性差異（P＞0.05）。

②培養物對小鼠體重的影響

將嗜酸乳桿菌La-0231菌株轉接至MRS液體培養基中，37℃兼性厭氧培養48h后，將部分培養液常溫下濃縮5倍，其余培養液直接供試驗用。分別試驗對雄性小鼠體重和雌性小鼠體重的影響。結果見表4、表5。

表4 嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養物對雄性小鼠體重的影響

從表4的檢測結果可以看出，雄性小鼠的初始體重和終體重在培養物組與其相應的對照組間比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。即在試驗期間，嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養物對雄性小鼠體重無影響。

表5 嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養物對雌性小鼠體重的影響

從表5的檢測結果可以看出，雌性小鼠的初始體重和終體重在培養物組與其相應的對照組間比較，差異均無顯著性（P＞0.05）。即在試驗期間，嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養物對雌性小鼠體重無影響。

③活菌對小鼠毒性作用結果

將受試物以0.02mL/g體重的劑量給小鼠灌胃，連續灌服3d，觀察7d，記錄實驗過程中小鼠的中毒表現或死亡情況。結果見表6。

表6 嗜酸乳桿菌La-0231菌株活菌對小鼠毒性作用情況

從表6的檢測結果可以看出，以0.02mL/g體重劑量嗜酸乳桿菌La-0231菌株活菌培養物（原液和濃縮液），給小鼠灌胃，連續灌服3d，觀察7d，未見受試小鼠有毒性反應或死亡情況。

3 討論

3.1 菌株分離鑒定

張雅茹等（2017）從青海酸奶中分離出一株嗜酸乳桿菌，經細菌形態學和16SrDNA序列同源性分析鑒定確認，并對其進行了降血脂的研究[4]。吳家鑫等（2019）從廣西桂林市黃洛瑤寨地區淘米水發酵液中分離得到3株嗜酸乳桿菌疑似菌株，其中3號菌株菌落形態、顯微形態、革蘭氏染色符合嗜酸乳桿菌特征；46項生理生化指標與嗜酸乳桿菌接近，鑒定可信度達到90%；經過16SrDNA鑒定后，其與嗜酸乳桿菌的同源性高達99%，確認其為嗜酸乳桿菌，命名為CFC-001[5]。王麗等（2017）從健康雞腸道中分離獲得3株疑似乳桿菌，并對其分別命名。通過對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌試驗，以及耐受性試驗獲得一株益生效果較高的菌株S-3，通過傳統的形態、生理生化方法和16SrDNA分子鑒定，確定S-3為嗜酸乳桿菌[6]。蔡熙姮等（2020）從藍狐的腸道內容物中分離到1株優勢乳酸菌，命名為ZJBF300。經菌落形態、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析將其鑒定為嗜酸乳桿菌[7]。胡國才等（2015）從仔豬新鮮糞便中分離純化了1株嗜酸乳桿菌菌株La-5，通過逐步提高培養基酸度、膽鹽濃度和培養溫度，對分離菌株進行馴化，獲得一株具有耐低pH、高濃度膽鹽及高溫特性的菌株La-5c[8]。杜志琳等（2016）從健康豬腸道內容物中分離獲得5株疑似乳桿菌菌株，通過生理生化和分子生物學鑒定方法，綜合確定其中一株菌為嗜酸乳桿菌，命名為HEW-A701。并對其耐酸性能、耐膽鹽性能和對致病菌拮抗性能進行研究[9]。張艷萍等（2017）從健康仔豬糞便中分離獲得9個菌株，通過對菌株形態及生理生化特性鑒定，得到2株疑似嗜酸乳桿菌菌株，分別命名為L102和L106，通過16SrDNA分析表明，菌株L102和L106均為嗜酸乳桿菌，并對2株菌的益生特性進行研究[10]。梁東梅等（2018）選取健康豬糞便，利用選擇性培養基進行厭氧培養和單克隆純化，共獲得3株乳酸桿菌，通過生化鑒定、16SrRNA基因序列測定和同源性分析，確定其中一株分離菌株為嗜酸乳桿菌。采用牛津杯法、活菌計數法和細胞試驗等研究了其體外抑菌活性、黏附性及競爭性黏附豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)的益生特性[11]。本試驗從菌落形態、菌體顯微形態、革蘭氏染色著手，分離、純化菌種，通過生理生化特性和16SrDNA基因序列分析，將其鑒定為嗜酸乳桿菌，命名為La-0231菌株。

3.2 菌株特性分析

杜金城（2017）測試了4株嗜酸乳桿菌（KLDS1.0901、1.0902、1.1003和NCFM）對10種抗生素（青霉素、阿莫西林、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、四環素、利福平、萬古霉素和氯霉素）的敏感性，結果KLDS1.0901菌株對氨基糖苷類的慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素耐受，對其余7種抗生素敏感；KLDS1.0902菌株對慶大霉素和卡那霉素耐受，對其余8種抗生素敏感；KLDS1.1003菌株與KLDS1.0902菌株一致；NCFM菌株對慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素耐受，對四環素和利福平中介，對其余5種抗生素敏感[12]。于鴻晶等（2019）采用最低抑菌濃度法檢測嗜酸乳桿菌YIT2004菌株對抗生素的敏感性，提取YIT2004菌株基因組，用特異性引物對耐藥基因進行PCR擴增。結果顯示嗜酸乳桿菌YIT2004菌株對青霉素、氨芐西林、亞胺培南、慶大霉素、紅霉素和克林霉素敏感，對萬古霉素固有耐藥且其耐藥性不可傳遞[13]。本試驗采用K-B法，測定了嗜酸乳桿菌La-0231菌株對30種抗生素的敏感性，結果顯示其對22種抗生素敏感，對5種抗生素中度敏感，對3種抗生素不敏感。毒力試驗測試結果說明，嗜酸乳桿菌La-0231菌株培養物對雄性和雌性小鼠體重無影響；以0.02mL/g體重劑量活菌培養物（原液和濃縮液），給小鼠灌胃，未見受試小鼠有毒性反應或死亡情況。

4 結論

本試驗采用仔豬新鮮糞便，從菌落形態、菌體顯微形態、革蘭氏染色著手，分離、純化菌種，通過生理生化特性和16SrDNA基因序列分析，將分離純化菌株鑒定為嗜酸乳桿菌，命名為La-0231菌株。采用K-B法，測定了嗜酸乳桿菌La-0231菌株對30種抗生素的敏感性，結果顯示其對青霉素、羧芐青霉素、四環素、慶大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、鏈霉素、強力霉素、克拉霉素、氯霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、呋喃妥因、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、復方新諾明敏感；對環丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感；對氟羅沙星、洛美沙星、諾氟沙星不敏感。毒力試驗測試結果說明，嗜酸乳桿菌La-0231菌株對動物安全，是一株有待開發利用的豬源嗜酸乳桿菌。