堿提酸沉法浸提時間對青皮中橙皮苷提取率的影響

楊莉，張藝，王琤韡

（江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

青皮（Citrus reticulata Blanco）為蕓香科植物橘及其變種的未成熟果實之外皮，是一種常用中藥。傳統中醫理論認為其具有疏肝破氣、消積化滯的作用，可以有效治療胸脅脹痛、疝氣、乳核、乳痛、食積腹痛等一系列病癥[1]。青皮中主要含有黃酮類化合物、揮發油等成分，其中黃酮類化合物以橙皮苷、川青皮素、桔皮素為主[2-3]。在黃酮類化合物中，橙皮苷因其優異的生理和藥理活性而在相關技術標準中作為衡量青皮質量控制的指標性成分[4]。大量的研究表明橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗輻射、降血脂、調節心血管系統、保護神經系統等多種生理活性，是一種綠色優良的飼料添加劑，也可用于保健食品、化妝品等非醫用領域，具有很高的應用價值和經濟價值[5-6]。我國的柑橘資源十分豐富，最主要的出口產品就是橘片罐頭，而加工廢棄的果皮大部分被丟棄，既浪費資源又污染環境[7]。因此，生產一種提取方法簡單，橙皮苷提取率高的粗制橙皮苷對天然物產資源合理利用，推進橙皮苷的綜合應用具有重要意義。但目前青皮中的橙皮苷提取轉移率普遍較低，因此，如何在低成本的基礎上高效地提取出橙皮苷就成為了一個研究熱點[8]。橙皮苷常見的提取方法有水回流法、堿提酸沉法、索式提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等，其中堿提酸沉法是一種成本較低、工藝簡單，而提取率又較高的提取方法。青皮的炮制方法、粉碎程度、提取溫度、堿的種類、提取時間及料液比等因素都會影響橙皮苷的提取率。本試驗研究提取時間這一因素對堿提酸沉法提取橙皮苷的影響，為優化青皮的提取工藝提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料

未成熟柑橘購自云南省昆明市市場。

1.1.2 試驗試劑

橙皮苷對照品（純度≥98%），購自濟寧天之藍生物科技有限公司。氫氧化鈣、鹽酸、無水乙醇、硝酸鋁均為國產分析純，試驗用水為純凈水。

1.1.3 試驗儀器

電子天平（FA-1004），上海力辰邦西儀器科技有限公司；雙光束紫外分光光度計（UV-722），上海佑科儀器儀表有限公司；鼓風恒溫干燥箱（101-2B），唯恒機械設備有限公司；予華牌循環水式真空泵（SHZ-DⅢ），長沙明杰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 橙皮苷標準曲線的繪制

精確稱取橙皮苷標準品10mg，加入10%硝酸鋁溶液0.6mL，用70%乙醇定容至100mL容量瓶中。精確量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分別置10mL具塞試管中，并用70%乙醇將其補足至10.00mL，分別得到質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/mL的標準樣液。以70%乙醇溶液作為對照液，用雙光束紫外分光光度計在480.0nm測量各試管中溶液的吸光值。以橙皮苷質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制橙皮苷標準曲線。結果表明：橙皮苷在0.01～0.06mg/mL范圍內濃度與吸光度呈良好線性關系，得到線性回歸曲線方程：Y=1.1X＋0.0123，R＝0.999。

1.2.2 橙皮苷提取工藝流程

柑橘皮晾干后切碎并用攪拌機粉碎至粉末狀，過60目篩，柑橘皮渣放干燥器中備用。取20g柑橘皮粉末平均分為4組，按液料比30:1加入蒸餾水，再加入0.3g氫氧化鈣調節pH至堿性，室溫提取0.5、1、1.5、2h。減壓抽濾，潤洗殘渣，合并濾液。濾液用0.1mol/LHCl調節至酸性，靜置12h結晶，用循環水式真空泵減壓抽濾，用無水乙醇洗滌至洗滌液無色，70℃鼓風恒溫干燥箱烘干，稱重得橙皮苷粗提物。分別將所得橙皮苷粗提物加入10%硝酸鋁溶液，分別用70%乙醇溶液定容至10mL，搖勻。用雙光束紫外分光光度計在480nm測定各試管中溶液的吸光值，將所測吸光值代入標準曲線得出浸提液橙皮苷質量濃度，根據提取率計算公式可得不同浸提時間橙皮苷的提取率。重復3次取平均值。

1.3 測定指標與方法

1.3提取率

將所測吸光值代入標準曲線得出浸提液橙皮苷質量濃度，再根據以下公式計算提取率：

式中：C為測定橙皮苷質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數；W為樣品重量，g。

1.4 數據處理

使用SPSS 20.0軟件對所有數據進行初步處理。

2 結果與分析

在不同的浸提時間下，橙皮苷的提取率見表1。由表1可知：青皮在浸提時間為0.5h與1h的橙皮苷提取率均值差異達到了顯著水平，表明浸提時間對橙皮苷提取率有顯著性影響。橙皮苷的提取率隨著浸提時間的增長，呈先上升再下降的趨勢（見圖1）。由圖1可知，當提取時間為1h時，橙皮苷提取率最高，達到了1.06%，而超過1h后，橙皮苷提取率開始降低，表明堿提酸沉法提取橙皮苷的最佳浸提時間為1h。

3 討論

本試驗采用傳統的堿提酸沉法研究浸提時間對青皮中橙皮苷提取率的影響，堿提酸沉法的原理是利用橙皮苷含有酚羥基的特點，其在堿性條件下酚羥基開環生成鹽，其水溶性增大溶解，進而在酸性條件下閉環沉淀進行分離。本研究在前期試驗中對溶解橙皮苷的試劑進行了篩選，探究了傳統工藝中2種常用溶劑甲醇、乙醇對橙皮苷提取率的影響。結果發現，使用甲醇溶解可在一定程度上提高橙皮苷提取率，但甲醇存在成本較高、毒性較強、環境不友好等缺點，因此本試驗采用環境更友好的乙醇溶解提取橙皮苷。在溶解橙皮苷的試劑選擇上，李繼偉[9]等對石灰水、NaOH和70%乙醇三種常見溶劑提取柑橘皮中黃酮提取率進行比較，結果表明用石灰水提取法的黃酮提取率較高，與NaOH提取法相當，還可以有效降低雜質果膠的提取率?？紤]到若將該提取工藝應用于工廠的實際生產中，NaOH提取法將增加操作時間以及成本，這將導致設備與操作成本高于該提取工藝可獲得的收益，故選擇石灰水作為提取溶劑。在增加提取輔料的選擇上，有研究表明，添加提取輔料如表面活性劑（吐溫80[10]、十二烷基磺酸鈉）、果膠酶[11]與纖維素酶[12]等能夠有效提高橙皮苷提取率，但增加輔料會大大增加生產成本和操作難度，且現在相關技術并不十分成熟，故本試驗不添加提取輔料進行提取。本方法成本較低，操作簡單，提取效率較高，所用有機溶劑量較少，適合工業生產中提高生產率降低成本。

表1 橙皮苷的提取率

圖1堿提酸沉法浸提不同時間的橙皮苷提取率

青皮和陳皮中均含有橙皮苷，研究表明陳皮中橙皮苷的提取率高于青皮，最高不超過30%。目前關于青皮中橙皮苷的提取工藝研究較少，而關于陳皮中橙皮苷的提取工藝文獻較多。青皮中橙皮苷的提取率與橙皮苷的炮制方法、粉碎程度、提取溫度、堿的種類、提取時間及料液比等因素都有關聯。趙琴等[13]在研究橙皮苷的傳統制作工藝時發現，通過適當增加乙醇濃度、提高浸提溫度或合理延長浸提時間可以使橙皮苷更充分地游離出來，從而提高提取率。鄧敏敏等[14]用超聲強化堿熱浸提取柚皮中橙皮苷，通過正交試驗，結果表明，顯著影響橙皮苷提取率的因素大小依次為：液料比＞提取溫度＞提取時間＞提取次數。本試驗研究結果表明，堿提酸沉提取橙皮苷的最佳浸提時間是1h，在此條件下橙皮苷提取率是1.06%。這可能是因為堿液中的橙皮苷查爾酮對氧氣較為敏感，提取的時間過長會導致大量橙皮苷查爾酮被氧化，從而降低其產品收率。本研究只對堿提酸沉法的浸提時間與橙皮苷提取率的關系做出探究，并未全面考察影響橙皮苷提取率的其他因素。其他因素對橙皮苷提取率的影響及粗制橙皮苷的抗氧化能力以及活性氧自由基的清除能力還有待進一步研究。

4 結論

本試驗研究表明，堿提酸沉法的浸提時間會顯著影響橙皮苷提取率，最佳浸提時間為1h，橙皮苷提取率可達1.06%。