三陰性乳腺癌患者新輔助化療前后MCM7基因表達及臨床意義

雷海

(德陽市人民醫院乳腺外科，四川 德陽 618000)

微小染色體維持蛋白(MCM)是廣泛存在的保守蛋白質，對真核細胞復制作用明顯。MCM7是MCM 復合體之一，保證1個細胞周期中DNA復制1次〔1〕。MCM7功能異?？赡軙е抡＜毎鲋钞惓?。MCM7基因會導致一些腫瘤的抑制因子表達，與肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的浸潤、轉移等生物學行為密切。目前國內外對MCM7有少數報道，主要集中在免疫組化檢測方面。同時免疫組化和PCR兩種方法在乳腺癌新輔助化療前后變化的檢測仍未見有報道。目前研究認為MCM7在乳腺癌的早期作用明顯，在乳腺癌的化療后表達如何仍未見有報道。MCM7蛋白及mRNA能否反映化療效果，是否有潛在的靶向治療意義仍沒有答案，尤其對于三陰性乳腺癌。

三陰乳腺癌分化差，內分泌治療和人表皮生長因子受體(HER)-2靶向治療效果差，治療手段單一，預后較差。三陰乳腺癌對化療較為敏感〔2,3〕。以前對乳腺癌新輔助化療(NAC)療效的評定僅限于以化療前后癥狀及體征來評定，很少有從乳腺癌分子機制對化療療效客觀評價的報道。本研究通過檢測三陰乳腺癌新輔助化療前后MCM7 水平的變化情況，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2017年12月德陽市人民醫院乳腺科52例Ⅱ～Ⅲ期三陰性初治乳腺癌女性病人〔4〕。年齡為36～62歲，中位49歲。TNM分期標準：Ⅱ期24例，Ⅲ期28例。血常規、肝腎功能檢查、心電圖均無明顯異常。全部患者確診前未接受過任何全身及局部治療，Karnofsky 評分均>90分。入組條件：①術前患者均行粗針穿刺病檢，確診乳腺浸潤性導管癌；②腫瘤大于3 cm，免疫組化雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和HER-2均為陰性，熒光原位雜交技術(FISH):無擴增。 ③患者均為初治乳腺癌患者，無內分泌治療及放療等任何治療。 ④患者化療前行肺部、肝臟等增強CT檢查和骨掃描檢查，無全身轉移。

1.2新輔助化療 52例患者術前NAC方案均采用TEC方案：第1天，予以多西他賽60 mg/m2(深圳萬樂公司產品)，表柔比星 60 mg/m2(深圳萬樂公司生產)；第2天，環磷酰胺 500 mg/m2，21 d為1個周期。6個化療周期結束后行乳腺癌改良根治術。

1.3檢測項目及方法

1.3.1標本及試劑 術前經14G空心活檢針(BARD公司)穿刺組織及新輔助化療后術中切取的組織標本作為檢測標本。常規行組織的包埋石蠟、制片及組化檢測。

濃縮型兔抗人MCM7單抗(美國abcam公司)，稀釋濃度為1∶100。Trizol購自中國的碧云天公司，試劑盒(逆轉錄)購自Promega公司，熒光定量PCR試劑盒及引物合成均購自大連生物公司。

1.3.2免疫組化檢測 免疫組織化學檢查采用S-P兩步法。 鼠抗人MCM7的單抗(濃縮型)購自abcam公司。整個過程按說明書進行。用已有陽性切片作為陽性的對照，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)。 免疫組化參考Nishihara等〔5〕報道的標準，棕黃色細顆粒在細胞核內為MCM7陽性。隨機選取5個陽性染色區利用Image J軟件對陽性細胞率檢測。使用Image J軟件檢測腫瘤組織平均的光密度，進行MCM7水平測定半定量。

1.3.3熒光定量的逆轉錄酶鏈聚合反應(RT-PCR) 組織勻漿：粉碎液氮后的標本，每50～100 mg標本加入1 ml TRIzol試劑，溶化勻漿。漿液常溫置5 min，充分解離核酸及蛋白。每1 ml TRIzol勻漿液中加入0.2 ml氯仿，劇烈搖震15 s后靜置2～3 min。4℃溫度下10 000r/min離心10 min。取上層(無色)移到另試管中，算所取水相量。加入等體積異丙醇(預冷)。靜置10 min，充分沉淀RNA。4℃ 10 000 r/min將其離心10 min。去清液，每管加1 ml 75%酒精去除殘存的異丙醇。4℃溫度7 500 r/min離心5 min。棄除上清液，沉淀干燥RNA。適量無核糖核酸酶(RNase)水溶解RNA沉淀。

盲選樣行預先實驗，確定反應條件。反轉錄和熒光PCR反應：取1 μg RNA行cDNA合成，取5 倍緩沖液 4 μl、引物1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、Rnasin 20 U、逆向M-MuIV逆轉錄酶(20 U/μl)1 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)至20 μl，25℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，逆轉錄合成cDNA。熒光定量PCR體系25 μl中含SYBR Green Mix 12.5 μl。制定定量反應溶解曲線和標準曲線，以內參GAPDH對MCM7 mRNA行定量檢測。熒光定量PCR擴增條件的設置：94℃ 4 min；94℃ 20 min；60℃ 30 min；72℃ 30 min，循環35次，72℃時檢測信號。擬定閾值為產物所達到的循環圈數即Ct值(定量結果)。分析每例標本的MCM7 mRNA表達水平。引物序列：MCM7F正義鏈：5'-TCCCTCGTAGTATCACGGTGC-3'，反義鏈：5'-ATGGGCTTCCAGGTAGGTTTC-3';(158 bp)；β-actin正義鏈：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'。反義鏈：5'-ACCACAGCCTCGCTCACG-3'(205 bp)。

1.4結果判定 NAC后的病灶變化按世衛組織(WHO)抗腫瘤藥物客觀療效評定〔4〕進行。分別在NAC前及NAC后2個周期和4個周期及化療結束后由臨床及影像科的主治以上醫師根據病灶變化認定效果。劃分完全的緩解(CR)，部分的緩解(PR)，穩定狀態(SD)，進展狀態(PD)。CR+PR為臨床病灶總緩解率。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1病灶體積變化及組織學改變 新輔助化療后2個周期：40例患者的腫塊明顯縮小，CR 3例，PR 37例，總緩解率為76.9%(40/52)。PD 1例,立即行乳腺癌手術。新輔助化療后4個周期后43例患者的腫塊明顯縮小，CR 7例，PR 36例，總緩解率為87.8%(43/52)。新輔助化療結束后47例患者的腫塊縮小明顯，CR 12例，PR 35例，總緩解率90.4%(47/52)，SD 4例，PD 1例。

30例術后標本肉眼顯示癌組織邊界較明顯，切面多為灰白色，砂礫樣。光鏡下可見部分腫瘤細胞有壞死變性現象，部分胞質壞死凝固、細胞核皺縮。腫瘤區的管腔、血管變窄，有的甚至閉塞萎縮。鏡下可見MCM7蛋白主要在細胞核，很少表達在細胞質，呈顆粒狀。在癌旁正常組織未見表達。見圖1。

圖1 NAC前、后MCM7蛋白表達(S-P，×400)

2.2MCM7蛋白表達 新輔助化療后MCM7蛋白明顯表達低于化療前(P<0.05)。CR+PR組化療前MCM7蛋白表達比化療后高，有顯著差異(43.12±8.45 vs 21.87±6.17，P<0.05)，SD+PD組化療前MCM7蛋白表達高于化療后，但無顯著差異(43.45±6.25 vs 37.41±5.81，P>0.05)。

2.3MCM7 mRNA表達 新輔助化療前后MCM7 mRNA檢測:52例患者新輔助化療前后乳腺癌標本中的MCM7 mRNA表達分別為0.17±0.07和 0.12± 0.05?；熀驧CM7 mRNA的表達水平較化療前低，但無統計學意義(P=0.062)。CR+PR組化療前MCM7 mRNA表達高于化療后，有顯著差異(0.175±0.06 vs 0.109±0.07;P<0.05)，SD+PD組化療前MCM7 mRNA表達高于化療后，但無顯著差異(0.164±0.05 vs 0.158±0.06；P>0.05)。

3 討 論

三陰乳腺癌是乳腺癌的亞型。研究表明，三陰乳腺癌對化療敏感性較其他亞型高〔3〕,新輔助化療在三陰乳腺癌治療中的效果更突出。三陰乳腺癌缺乏有效的分子治療靶點，同時也與缺乏評估其治療效果的特征性分子指標。因此，找出能真正反映三陰性乳腺癌化療療效的分子指標至關重要。

MCM7可以與其他MCM蛋白聚成多聚物，在調控DNA復制和延伸中有重要作用，同時與細胞周期的調控、轉錄、細胞增生、惡性腫瘤關系緊密〔6,7〕。此外MCM7蛋白還在一些抑癌及致癌信號通道中有關鍵作用，有研究提示MCM7蛋白在惡性腫瘤早期階段有重要作用〔8,9〕。研究〔10,11〕表明，MCM7蛋白在霍奇金淋巴瘤、肺癌等多種惡性腫瘤細胞中均呈高表達，是一種判斷癌細胞的生物學行為指標。本研究中發現MCM7蛋白主要表達在乳腺癌細胞核中，在正常腺體細胞中較少表達。表明MCM7是乳腺癌的特異性表達蛋白，對乳腺癌診斷有價值。也表明其可能是乳腺癌潛在的基因治療靶點。研究表明〔12〕，MCM7在鼠、樹鼩、人的肝癌組織中蛋白表達明顯高于正常肝組織及癌旁中的表達水平，與本研究結果相同。

本研究免疫組化結果表明MCM7蛋白表達水平可成為簡單有效判斷新輔助療效的病理指標。MCM7 mRNA檢測和MCM7蛋白是相似的。表明MCM7蛋白能夠替代MCM7 mRNA的檢查反映MCM7基因的變化。Coli等〔13〕發現MCM7可為預測垂體腺癌復發及進展獨立因素。Qu等〔14〕研究發現，原發性肝癌的預后與MCM7表達有關；通過敲除MCM7基因功能可以顯著抑制腫瘤生長，激活MAPK信號，上調CyclinD1表達，促進腫瘤進展和轉移。本實驗表明新輔助化療能明顯緩解三陰乳腺癌患者病情進展，可能與抑制乳腺癌組織MCM7表達相關。MCM7對于判斷乳腺癌的浸潤、預后及轉移意義重大，可能是乳腺癌的分級特異基因。

綜上所述，在乳腺癌的發生及發展過程中，MCM7蛋白的高表達和三陰乳腺癌的進展相關密切，檢測MCM7蛋白和MCM7 mRNA可作為判斷新輔助化療效果的生物學指標。MCM7蛋白可代替MCM7 mRNA反映MCM7基因的變化。由于MCM蛋白在三陰性乳腺癌細胞異常增殖調控中的重要作用，研究調控細胞MCM7蛋白表達有利于抗癌藥物的靶向研究。