結直腸癌組織CD151與MT1-MMP蛋白、mRNA表達及相關性

于秀文 劉婷 徐晨 李雪松 榮瑋

(齊齊哈爾醫學院病理學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

結直腸癌(CRC) 發病率居全部惡性腫瘤的第3位、病死率居第5位〔1〕。CRC發生是一個復雜過程，在此過程中癌細胞與腫瘤微環境多種成分相互作用。CD151屬于四跨膜蛋白超家族(TM4SF，也稱tetraspanin)成員，具有連接膜內外信號通道，促進tetraspanin信號網絡中結合蛋白，參與和調節細胞生長、黏附、遷移、侵襲及信號傳遞等多種功能〔2,3〕。CD151在消化系統腫瘤中差異表達與腫瘤轉移、預后密切相關〔4〕。膜型基質金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)是一種影響腫瘤轉移及進展的重要蛋白酶〔5,6〕，通過激活基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13等或直接降解腫瘤細胞周圍間質并加速血管生成。文獻報道〔7〕內皮細胞連接處，MT1-MMP與CD151及其相關伴侶整合素α3β1共定位。研究發現CRC CD151與整合素α3β1的表達具有協同作用〔8〕，但CRC組織CD151與MT1-MMP相互作用未見報道。本研究探討CRC CD151與MT1-MMP蛋白及mRNA表達相關性及潛在作用機制。

1 資料和方法

1.1臨床資料 選擇2015年1月至2017年12月齊齊哈爾醫學院附屬醫院原發CRC患者64例根治性切除的新鮮標本，術前均未經放療、化療等任何治療。TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期17例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。所有切除組織在不影響病理診斷的前提下，立即無菌操作一次取材適量的新鮮癌組織并標記，取10 mg放入RNase Free EP管內，置于-80℃超低溫冰箱內凍存，剩余組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色病理診斷證實均為CRC。對照組為對應遠切端正常結直腸組織64例(距癌邊緣>5 cm，經HE證實無癌細胞浸潤)。

1.2主要試劑 鼠抗人CD151、MT1-MMP多克隆抗體濃縮液購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組織化學試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新生物技術公司。PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)RT-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司。CD151、MT1-MMP1及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3免疫組化 采用免疫組化二步法，切片常規脫蠟水化，3% H2O2-甲醇封閉內源性過氧化物酶20 min，枸櫞酸高壓修復10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 min×3次，一抗(鼠抗人CD151、MT1-MMP多克隆抗體，工作液濃度為1∶600)4 ℃冰箱過夜，次日取出恢復室溫后，依次滴加反應增強液，酶標抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫各孵育15 min，PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，其余步驟按說明書進行。以PBS代替一抗作陰性對照，胃癌組織作陽性對照。

1.4qRT-PCR檢測 取-80℃凍存的腸癌組織按Trizol試劑盒說明抽提組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA的濃度及純度，A260/A280比值在1.8～2.1之間，總RNA樣品置-80℃保存備用。按照cDNA反轉錄反應試劑盒說明書進行反轉錄，獲得所需cDNA。按照實時定量PCR試劑盒的操作步驟，進行PCR，PCR液配制在冰上進行，反應體系20 μl。CD151：正義鏈：5'-TGACTACATCAGCCTGCTG-3'，反義鏈：5'-AGCAGGATGAAGTACAGGC-3'；MT1-MMP1：正義鏈：5'-CCAATGTTCGAAGGAAGCG-3'，反義鏈：5'-GGGTGTAATTCTGGATGCAG-3'；GAPDH：正義鏈：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，反義鏈：5'-GAGATGGTGATGGGATTTC-3'，共40個循環。

1.5免疫組化法判定 采用半定量積分法。所有切片采用盲法由兩位病理醫師獨立閱片，CD151和MT1-MMP陽性產物呈棕褐色顆粒狀，位于細胞膜和(或)細胞質。隨機觀察10個高倍視野，每個視野記數100個細胞，根據CD151和MT1-MMP陽性細胞的比率進行評定。(1)按陽性細胞的比率評分：0分為陽性細胞數占總細胞數≤5%；1分為5%～20%；2分為21%～50%，3分為51%～75%，4分為75%以上。(2)按染色強度評分：0分為細胞無棕色顆粒與背景一致；1分為細胞出現弱棕色或棕黃色顆粒；2分為出現中等強度棕色或棕黃色顆粒；3分為出現強棕色或棕黃色顆粒。(3)總積分=陽性細胞的比率評分+染色深度評分：0～1分為陰性(-)；2分及以上為陽性(+)。

1.6qRT-PCR法判定 根據CD151和MT1-MMP基因擴增的CT值，以GAPDH作為內參，用2-ΔΔCt法比較CT值。

1.7統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1遠切端正常黏膜與CRC CD151和MT1-MMP蛋白的表達 CD151蛋白陽性呈棕褐色顆粒狀，遠切端正常腸黏膜分布在上皮細胞基底面和外側面的細胞膜，表達弱，而在CRC組織分布于細胞膜和(或)細胞質，呈彌漫強表達。遠切端正常腸黏膜、CRC組織CD151蛋白表達陽性率(20.3%vs 73.4%)差異有統計學意義(χ2=36.267，P=0.000)。MT1-MMP蛋白陽性呈棕褐色顆粒狀，位于細胞膜和細胞質，在正常腸黏膜表達較弱，而在CRC組織和間質中彌漫分布，呈強表達或僅在間質強表達(圖1)。遠切端正常腸黏膜、CRC組織MT1-MMP蛋白表達陽性率(17.2% vs 62.5%)差異有統計學意義(χ2=27.412，P=0.000)。

2.2CRC CD15蛋白與MT1-MMP蛋白表達與臨床病理因素的關系 CRC組織CD151和MT1-MMP蛋白表達與患者年齡、性別、發生部位及腫瘤最大直徑無相關性，與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關。CD151與CRC的分化程度有關，見表1。

2.3CRC CD151與MT1-MMP蛋白表達的相關性 64例CRC中CD151、MT1-MMP蛋白表達均陰性13例，陽性36例，CD151陰性MT1-MMP陽性4例，CD151陽性MT1-MMP陰性11例。兩者呈正相關(r=0.496，P=0.000)。

2.4CRC CD151和MT1-MMP mRNA表達 遠切端正常黏膜CD151和MT1-MMP mRNA相對表達水平(0.780 9±0.092 89、0.567 5±0.067 98)顯著低于CRC(4.221 6±0.320 14、3.937 2±0.310 33；均P=0.000)。

圖1 遠切端正常黏膜與CRC CD151和MT1-MMP蛋白表達(免疫組化二步法，×200)

2.5CRC CD151和MT1-MMP mRNA表達的相關性 CRC組織CD151和MT1-MMP mRNA的表達呈正相關(r=0.784，P=0.000)，見圖2。

圖2 CRC CD151和MT1-MMP mRNA表達相關性

3 討 論

CD151是外泌體蛋白中可作為腫瘤標志物的跨膜蛋白〔9〕，定位于人染色體11p15.5，全長1 443 kb，編碼253個氨基酸，由一大一小2個細胞外環和2個短的細胞內尾端構成，大的細胞外環與多種整合素相結合，將整合素接到的各種生物信號轉導到細胞內的重要結構基礎。CD151蛋白在多種癌細胞表面都有較高表達，并與腫瘤惡性進展、預后及治療等密切關系〔2〕。Sandfeld-paaulsen等〔10〕研究認為外泌體CD151可作為檢測肺癌的標志物。本研究結果結果表明CRC CD151 mRNA高于遠切端正常黏膜，與CD151蛋白表達結果相一致，提示CD151基因參與了CRC的發生、分化，并與侵襲及轉移密切相關。文獻報道〔11〕CD151是TM4SF中與腫瘤侵襲轉移關系最為密切的因子，能促進內皮細胞遷移和微血管增生，有利于腫瘤細胞的浸潤和轉移。

MT1-MMP是腫瘤外泌體重要的蛋白酶〔12〕，基因定位于14q11，由10個外顯子和9個內含子組成，編碼582個氨基酸。MT1-MMP在腫瘤發生發展及侵襲轉移中發揮重要作用。研究認為MT1-MMP在肺癌、胃癌、喉癌等多種惡性腫瘤中表達量和強度均上調，并和惡性腫瘤的分化程度、淋巴結轉移及臨床TNM分期關系密切〔13,14〕。本研究結果提示MT1-MMP基因在mRNA及蛋白水平均參與了CRC的發生。文獻報道，腫瘤來源的外泌體富含促使細胞外基質降解的MMP，黑色素瘤和纖維肉瘤細胞來源的外泌體釋放的MT1-MMP可降解膠原蛋白，促進惡性腫瘤轉移〔15〕。

外泌體四跨膜蛋白在外泌體中形成功能性四跨膜蛋白復合物，四跨膜蛋白復合物包含各種蛋白質(CD82、CD151、Tspan8)及蛋白酶〔崩解蛋白和金屬蛋白酶(ADAM)、MMPs、MMP誘導劑(EMMPRIN)〕，在細胞運動、遷移、侵襲和轉移形成中起重要作用〔16〕。文獻報道CD151可直接與MMPs相互作用，調節其在細胞表面的定位、轉運，溶酶體降解和蛋白水解活性〔17〕。在處于3D細胞外環境的侵襲性癌細胞中，發現CD151-整合素α3β1復合體通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路調節MMP-2和MMP-9的產生。苗杰等〔18〕研究食管胃交界部腺癌顯示CD151與MT1-MMP蛋白均呈高表達，且CD151和MT1-MMP的表達呈正相關。本研究結果與文獻結果一致〔18〕。提示二者可能具有協同作用，共同參與CRC的發生、侵襲和轉移。結合研究結果，CRC CD151可能通過影響MT1-MMP及整合素α3β1促進CRC侵襲和轉移〔8〕。Yaez-Mó等〔7〕研究發現在血管內皮細胞MT1-MMP通過其血紅素結合蛋白結構域與CD151緊密結合，從而形成整合素α3β1/CD151/MT1-MMP復合物，敲除CD151基因直接影響MT1-MMP在亞細胞的定位和整合素α3β1的形成。但腫瘤中CD151與MT1-MMP具體作用機制及二者的相互作用尚不清楚，在外泌體、腫瘤細胞與腫瘤微環境這三者之間的關聯作用還有待深入研究。