桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分指數構建

李永生，楊媛媛，胡 靜，任 慧，崔小敏，曲 彤，李 寧，陳志永*

（1. 西安交通大學醫學院附屬紅會醫院 藥劑科，陜西 西安 710054；2. 陜西省中醫藥研究院 中藥所，陜西 西安 710003；3. 西安市食品藥品檢驗所 中藥室，陜西 西安 710054）

桑白皮為?？浦参锷orus albaL.的干燥根皮，具有瀉肺平喘、利水消腫等功效[1]。桑白皮中主要含有生物堿類、黃酮類、芪類、多糖類等成分[1-2]?，F代藥理學研究表明桑白皮及其活性成分具有降壓[3]、降糖[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等功效。張冉等[7]應用α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型篩選30 味常用清熱解表中藥的降血糖活性，發現鴨跖草、山慈菇和桑葉具有較好的降糖活性。而本課題組在前期研究中發現桑葉同源中藥桑白皮由于含有更多的異戊烯基黃酮類成分（桑根酮C、桑辛素等），其降糖活性優于桑葉[4]，同時兼具顯著抗炎、抗氧化活性，使桑白皮成為近年來治療糖尿病及其并發癥領域的熱門中藥[8-9]。2020 年版《中國藥典》（一部）收載桑白皮質量標準包括性狀鑒別、橫切面鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別，未收載桑白皮含量測定。段志濤等[10]建立了桑白皮藥材的質量標準，該標準包括薄層鑒別和含量測定，能較為全面反映桑白皮質量狀況。KIM K等[11]建立了桑白皮中桑黃酮G 和桑辛素的HPLC 含量測定方法，該方法能夠區分不同產地的桑白皮樣品。但現有桑白皮質量標準存在與臨床應用結合不緊密，指標性成分選取不合理，無法反映不同成分對藥材整體藥效的貢獻度差異等問題。

效應成分指數由肖小河課題組首次提出，即根據不同藥效成分生物活性的強弱，賦予不同藥效成分不同權重，不同藥效成分的權重乘以相應藥效成分的含量的加和即為效應成分指數，該指數僅通過測定成分的量便能體現藥材的效[12-13]。構建桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分指數有望緩解現行桑白皮質量標準存在的問題，實現不同批次桑白皮降糖活性的質量評價。本研究采用譜效關系的方法選擇了桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分，采用高效液相色譜法測定了指標性成分含量，并構建了效應成分指數，對進一步提升桑白皮質量控制水平有一定的意義。

1 材料與儀器

10 批次桑白皮藥材樣品經陜西省中醫藥研究院陳志永副研究員鑒定，標本存放于陜西省中醫藥研究院中藥所，樣品詳細信息見表1。桑皮酮H（批號：CHB170413）、氧化白藜蘆醇（批號：CHB1709-28）購自成都Chroma 生物技術有限公司；1-脫氧野尻霉素（批號：17093302）、桑黃酮G（批號：16030604）、桑根酮C（批號：16092105）、桑辛素（批號：161109）購自上海圻明生物技術有限公司，所有標準品純度均大于等于98%。對硝基苯酚吡喃葡萄糖苷（PNPG，4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside）和α-葡萄糖苷酶（來自Saccharomyces cerevisiae）購自美國Sigma-Aldrich 公司。乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher 公司），水為超純水，其它試劑均為分析純。

表1 桑白皮樣品信息Tab. 1 Samples information of Cortex Mori

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置VWD 檢測器和Agilent ChemStation B.04.03 工作站（美國安捷倫科技公司）；KQ-100 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；BS210S 型電子分析天平（萬分之一）、BT25S 型電子分析天平（十萬分之一）（北京賽多利斯天平有限公司）。

2 方法

2.1 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性譜效關系研究

2.1.1 樣品制備 取桑白皮藥材樣品粉碎，過40 目篩。精密稱取10 批次桑白皮樣品粉末各2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇水溶液100 mL 超聲提取2 次，時間為30 min，合并兩次提取液，在55 °C減壓蒸干。取30.0 mg 提取物，用70%甲醇水溶液溶解，并定容于5 mL容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，用于桑白皮指紋圖譜研究。取提取物20.0 mg 用于α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。

2.1.2 桑白皮指紋圖譜研究 采用Agilent 5 TC-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）進行色譜分析[14]。流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序為：0 ～ 15 min，5%→15%A；15 ～ 70 min，15%→25%A；70 ～ 90 min，25%A；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為280 nm；進樣量為10 μL。10 批次桑白皮樣品的指紋圖譜見圖1。

圖1 桑白皮樣品高效液相指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprint of Cortex Mori samples

2.1.3 桑白皮中1-脫氧野尻霉素含量測定 精密稱取“2.1.1”項下制備的桑白皮提取物20.0 mg，精密加入0.05 mol/L 鹽酸溶液4 mL，超聲提取30 min，補足失重，13 000 r/min 離心10 min。取2 mL 上清液，與4 mL 硼酸鹽緩沖液（pH = 8.5）混合，之后加入2 mL 乙腈溶解的FMOC-CL（10 mmol/L）溶液，在20℃下反應20 min。加入0.1 mL 甘氨酸 （1 mol/mL）溶液中和過量的FMOC-CL，加入1.9 mL 0.1% 乙酸水溶液用于使衍生物DNJ-FMOC 處于穩定狀態。溶液過0.45 μm 微孔濾膜，用于含量測定。桑白皮提取物中1-脫氧野尻霉素含量測定的色譜條件參考相關研究[15]。色譜分離在Inertsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）上進行。乙腈-0.1%乙酸水溶液（60 ∶40）為流動相；檢測波長為265 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為15 μL。

2.1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定方法參考本課題組之前研究[4]。50 μL 桑白皮提取物溶液與50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.25 U/mL）混合，37℃下孵育10 min，加入100 μL溶于磷酸鉀緩沖液的PNPG （5 mmol/L），繼續在37℃下反應10 min，之后加入1 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應。405 nm 下測定吸光度值，計算樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制率。采用阿卡波糖（10 μg/mL）作為陽性對照。

2.1.5 譜效關系研究 將桑白皮提取物指紋圖譜數據進行峰提取、峰對齊等處理。將不同批次樣品指紋圖譜峰面積、1-脫氧野尻霉素含量、α-葡萄糖苷酶抑制活性數據導入MarkerLynxxs（Waters，Milford，MA，USA）軟件，采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）得到造成α-葡萄糖苷酶抑制活性差異的化學成分。

2.2 桑白皮中5 種成分含量測定

樣品制備和含量測定方法參考本課題組之前研究[14]。取桑白皮藥材樣品粉碎，過40 目篩。精密稱取不同批次樣品粉末各1.0 g 置于100 mL 具塞錐形瓶中，70%甲醇水溶液50 mL 超聲（250 W, 40 kHz）提取30 min，補足失重，搖勻、濾過，取續濾液，0.45 μm 微孔濾膜即得供試品。精密稱取氧化白藜蘆醇、桑根酮C、桑黃酮G、桑皮酮H、桑辛素適量，加入70%甲醇水溶液中制成濃度依次為0.812 mg/mL、0.100 mg/mL、0.105 mg/mL、0.095 0 mg/mL、0.045 8 mg/mL 的混合標準品儲備液。色譜條件同“2.1.2”項下條件。

2.3 效應成分指數構建

根據譜效關系研究結果選取效應成分。效應成分指數（ECI）的構建方法參考本課題組前期研究[16]，其計算公式如下：

式中Wi為各效應成分的藥效權重，Wi值越大代表該成分與藥效的相關性越強。Xi代表各成分在桑白皮中的含量。Wi的計算公式如下：

3 結果與分析

3.1 桑白皮提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性譜效關系研究

將桑白皮提取物指紋圖譜峰面積數據（X）、1-脫氧野尻霉素含量測定數據（X）與提取物α-葡萄糖苷酶活性抑制數據（IC50，Y）進行PLS-DA 分析，詳細數據見表2。樣本經分析得到兩個主成分的模型，模型的解釋度R2（X）為85.0%，R2（Y）為91.1%，預測度Q2為75.4%，說明該模型解釋能力和預測能力良好，見圖2。利用VIP 分析可以驗證差異性變量，具有VIP 值大于1 的變量可以用來區 分 樣 本。 變 量var_3、var_12、var_4、var_19、var_15、var_7、var_20 和var_11 VIP 值大于1。通過篩除峰面積較小，以及峰形不規則的成分，最終采用標準品比對的方法確定變量var_3、var_12、var_4、var_19、var_15、var_7、var_20 和var_11 分 別 為 桑皮苷A、桑黃酮G、綠原酸、桑辛素、桑皮酮H、氧化白藜蘆醇、1-脫氧野尻霉素和桑根酮C。對8 個化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行驗證，結果表明桑黃酮G（IC50：13.38 μmol/L）、氧化白藜蘆醇（IC50：200.9 μmol/L）、桑辛素（IC50：85.91 μmol/L）、1-脫氧野尻霉素（IC50：10.80 μmol/L）、桑根酮C （IC50：26.78 μmol/L）和桑皮酮H （IC50：23.59 μmol/L）具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。作為陽性對照的阿卡波糖的IC50值為23.59 μmol/L，可見桑白皮中的幾種化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性較好。

圖2 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的PLS-DA 得分圖（A）和VIP 圖（B）Fig. 2 The PLS-DA score plot （A） and VIP plot （B） obtained from the groups of Cortex Mori against α-glucosidase inhibitory activity

表2 桑白皮譜效關系研究數據Tab. 2 Data of the spectrum-effect relationship of Mori Cortex

3.2 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的效應成分指數構建

根據譜效關系研究結果與體外活性篩選驗證，選擇桑黃酮G、氧化白藜蘆醇、桑辛素、1-脫氧野尻霉素、桑根酮C 和桑皮酮H 作為桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分。10 批次桑白皮中6 種成分的含量測定結果見表3。

將6 個效應成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50值導入公式得各成分Wi，將各成分Wi導入效應成分指數（ECI）計算公式：

將桑白皮中6 個成分的含量值帶入上述公式即得不同批次桑白皮的效應成分指數值。從表3 可見，不同批次桑白皮中6 個成分含量差異較大，很難通過成分含量的多少鑒定藥材的優劣。10 批次桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的效應成分指數，通過該圖可以很清晰的看出6號藥材α-葡萄糖苷酶抑制活性最優，見圖3。

表3 不同批次桑白皮中6 個活性成分的含量測定（mg/g，n = 3）Tab. 3 Quantification of six active components in different batches of Mori Cortex （mg/g，n = 3）

圖3 10 批次桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分指數Fig. 3 ECI of ten batches of Cortex Mori samples against α-glucosidase

3.3 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分指數的驗證

將“2.1.1”項下所制備的不同批次桑白皮提取物進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測試。將活性實測值與效應成分指數值進行相關分析，結果表明效應成分指數值與藥材α-葡萄糖苷酶抑制活性的1/IC50顯著相關（R= 0.983），表明所建立的效應成分指數能夠代表桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性。

4 討論

在建立效應成分指數的過程中，效應成分的選取是重中之重。本研究采用譜效關系結合實驗驗證的方法，選擇桑黃酮G、氧化白藜蘆醇、桑辛素、1-脫氧野尻霉素、桑根酮C 和桑皮酮H 作為桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應成分。采用該6 種成分構建的效應成分指數，與不同批次藥材活性實測值顯著相關，表明其能夠代表桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性。采用體外活性測試的方法構建效應成分指數，具有穩定、可控、重復性好等特點。然而，體外研究未考慮體內吸收、分布、代謝、排泄等過程，尚有改進空間。

生物堿類成分1-脫氧野尻霉素為桑白皮中主要降糖成分，其為含氮雜環糖類，此類物質在紫外-可見光區域無吸收，且在一般的反相色譜柱上基本不保留。因此，常選用氨基柱分離，蒸發光散射檢測器檢測。陳正收等[15]采用柱前衍生化的方法建立了桑白皮中1-脫氧野尻霉素的紫外檢測方法，采用FMOC-CL 衍生化后，其在反相色譜柱上具有較好的保留行為。在效應成分指數構建過程中，桑白皮中的黃酮類成分均采用紫外檢測器進行定量分析，為提高所構建效應成分指數的實際應用價值，對1-脫氧野尻霉素進行了柱前衍生化，采用紫外檢測的方法進行含量測定。

5 結論

構建的效應成分指數能較好地評價桑白皮樣品在α-葡萄糖苷酶抑制活性方面的質量，利于提升桑白皮質量控制水平，對推動桑白皮在糖尿病治療領域的應用具有一定的意義。