基于網絡藥理學探究補骨脂誘導的肝細胞線粒體損傷機制

王 姍，肖 瑩，張 弋，肖星雨，于英莉，3，4

（1.天津市第一中心醫院藥學部南開大學醫學院，天津 300192；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；3.組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；4.天津中醫藥大學方劑學教育部重點實驗室，天津 301617）

補骨脂來源于豆科類植物補骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的干燥成熟果實，其性味辛苦溫，歸腎、脾經，具溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉之功效。補骨脂是臨床常用中藥，中成藥復方二神丸、四神丸、加味青娥丸等均以補骨脂入藥。臨床數據表明長期大量服用補骨脂會產生肝毒性。據報道，有患者在服用含有補骨脂的白蝕丸后出現全身色素脫失斑，血清ALT（alanine transaminase，谷丙轉氨酶）、AST（aspartate aminotransferase，谷草轉氨酶）水平升高。ALT、AST水平是肝損傷的重要生化指標，表明白蝕丸可以導致肝毒性［1-2］。吳豪等［3］利用斑馬魚動物模型研究補骨脂水提物和醇提物所致肝毒性，結果發現兩種補骨脂提取物處理斑馬魚成魚后，動物肝臟均發生了脂變，斑馬成魚肝臟中固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC1）的mRNA表達水平顯著升高，而微粒體三酰甘油轉移蛋白（MTP）mRNA表達水平顯著降低。SREBP-1c是激活肝臟脂肪合成酶的重要轉錄因子，ACC1和FAS是肝臟脂質合成的重要酶，補骨脂誘導上述蛋白上調可以促進肝臟脂變。另外，使用尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UGT1A1）的特異性熒光探針N-（3-羧基丙基）-4-羥基-1，8萘酰亞胺（NCHN）研究補骨脂提取物及其成分對UGT1A1活性的影響，發現補骨脂的醇提取物對UGT1A1活性具有較強的抑制作用，并且呈現劑量依賴性。UGT1A1是消除膽紅素的關鍵酶，補骨脂通過抑制UGT1A1的活性使膽紅素的濃度升高，進一步導致高膽紅素血癥和急性肝損傷［4］。這些臨床數據和實驗數據表明，補骨脂可以導致人或動物發生肝損傷，但補骨脂誘導肝細胞損傷的機制還有待進一步研究，本實驗通過網絡藥理學研究補骨脂導致肝損傷的機制，為補骨脂臨床用藥安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據的獲取

補骨脂的活性成分從中醫藥系統藥理學數據庫分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲取?；钚猿煞值幕瘜W物質登錄號（CAS號）從化源網（https：//www.chemsrc.com/）獲取。藥物動力學（absorption，distribution，me-tabolism and elimination，ADME）篩選標準為：口服生物學吸收性（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-like，DL）≥0.14。利 用Drug Bank數 據 庫（http：//www.drugbank.ca/）查找線粒體損傷疾?。∕D）的相關靶點和活性化學成分的靶點，利用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行靶點的KEGG通路和GO功能分析。

1.2 分析補骨脂預測靶點與線粒體損傷疾病靶點相互作用

利用String網站建立補骨脂活性成分預測靶點的相互作用網絡（PPI），利用DAVID數據庫對節點進行GO富集及KEGG通路分析。采用韋恩分析補骨脂活性成分，預測靶點、線粒體疾病靶點的相關性。

2 結果

2.1 補骨脂有效物質及作用靶點的網絡構建

利用ADME篩選條件從TCMSP數據庫進行篩選，發現補骨脂所含有的117個化合物中沒有符合條件的物質。但是，通過文獻檢索發現其中的9種物質具有藥理作用，因OB值與DL值小于篩選條件而被系統刪除，考慮其潛在意義，故將這9個化合物納入研究范圍。結果見表1。

表1 補骨脂中9個有效活性化合物

同時，利用TCMSP數據庫獲取9個活性成分可能的藥理活性靶點共58個，包括細胞色素P4501A1（CYP1A1）、雄激素受體（AR）、鈣調蛋白（CALM1）、細胞色素P450 19A1（CYP19A1）、一氧化氮合酶（NOS）、葡萄糖激酶（GCK）、醛脫氫酶（ALDH2）、胺氧化酶（MAOA）等。結果見表2。

表2 TCMSP數據庫預測的分子靶點

將所獲得的有效活性化合物的58個預測蛋白靶點利用String網站建立補骨脂活性成分基因靶點的相互作用網絡（PPI）?？梢钥吹轿挥趫D中央的FOXO3、AKT1、TP53、HMOX1、STAT3、MAPK3、JUN、BCL2L、MAPK9、AR等基因是補骨脂有效成分的關鍵靶點。

2.2 補骨脂預測靶點的生物學分析與信號通路分析

圖1 補骨脂活性成分基因靶點的相互作用網絡

利用DAVID數據庫對節點進行GO富集分析，結果見表3～6，包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellu-larcomponent，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG通路分析。如表3所示，這些靶點主要涉及細胞對缺氧的反應（cellular response to hypoxia）、氧化還原過程（oxidation-reduction process）、對細胞因子的反應（response to cytokine）、線粒體膜通透性的調控（regulationofmitochondrialmembranepermeability）、脂多糖介導的信號通路（lipopolysaccharidemediated signaling pathway）、RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正調節作用（positiveregulation of transcription from RNApolymerase IIpromoter）和線粒體細胞色素C的釋放（releaseof cytochromec frommitochondria）等生物過程。

表3 補骨脂預測靶點GO生物過程富集分析

如表4所示，這些靶點組成胞漿（cytosol）、線粒體（mitochondrion）、線粒體基質（mitochondrial matrix）、核染色質（nuclear chromatin）、線粒體外膜（mitochondrial outer membrane）等細胞成分。

表4 補骨脂預測靶點GO細胞組分富集分析

如表5所示，這些靶點發揮了血紅結合（heme binding）、MAP激酶活性（MAP kinase activity）、ATP結合（ATP binding）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端序列特異性結合（transcriptional activator activity，RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding）等分子功能。

表5 補骨脂預測靶點GO分子功能富集分析

如表6所示，關鍵靶點KEGG富集分析中，排名靠前的信號通路主要涉及神經營養素信號通路（neurotrophinsignalingpathway）、癌癥途徑（pathways in cancer）、結直腸癌（colorectal cancer）、催乳素信號通路（hepatitis B）、百日咳通路（pertussis）、前列腺癌通路（prostate cancer）、胰腺癌相關信號通路（pancreatic cancer）。這提示補骨脂主要通過癌癥信號傳導途徑及激素調節信號通路發揮作用，這些通路與細胞的存活密切相關。

表6 補骨脂成分潛在致線粒體損傷靶點的KEGG代謝通路富集分析

2.3 韋恩分析補骨脂預測靶點與線粒體損傷疾病靶點的相關性

將補骨脂活性成分的預測靶點與致線粒體損傷疾?。∕D）靶點進行韋恩分析。如圖2及表7所示，2個數據交集共有19個基因靶點，這些靶點主要影響細胞氧化還原、細胞對缺氧的反應、調控線粒體膜的通透性、細胞線粒體細胞色素C的釋放等。這提示補骨脂活性成分的分子靶點中有19個與線粒體密切相關，因此補骨脂有損傷線粒體的潛在風險。

表7 預測靶點與線粒體疾病靶點的重合部分

圖2 補骨脂預測靶點與線粒體損傷疾病靶點相關性分析

2.4 補骨脂素和異補骨脂素誘導HepaRG、HepG2肝細胞損傷

為了驗證本研究中篩選的補骨脂活性成分的肝毒性，我們挑選了其中2個最具代表性的成分進行檢測。在本研究中HepaRG人肝癌細胞具有人原代肝細胞的大多數功能，對細胞色素酶（CYP酶）活性的影響與人的原代肝細胞表現基本相同，毒性研究的結果與人原代肝細胞也基本一致［5］，并且還可以在體外大量傳代，是體外研究化合物和藥物代謝的重要基礎，是替代人原代肝細胞較好的候選對象。最新研究表明HepaRG細胞系在藥物誘導的肝細胞氧化應激、線粒體損傷以及脂代謝紊亂中具有更強的特異性，與HepG2、L-02、hiHeps細胞系相比HepaRG細胞在肝毒性藥物的篩選方面更有優勢［6］。而在以往的肝毒性實驗中HepG2的使用率更高，更為經典［7］，因此我們利用HepaRG、HepG2細胞對補骨脂素和異補骨脂素的肝毒性成分進行鑒定。結果見圖3、表8。補骨脂素在HepG2肝 細 胞 的IC50為110.7μmol/L，在HepaRG肝細胞的IC50為336.6μmol/L，兩者的肝毒性具有顯著差異；異補骨脂素在HepG2肝細胞的IC50為1.4345μmol/L，在HepaRG肝細胞的IC50為75.17μmol/L，兩者的肝毒性具有顯著差異。

圖3 作用于HepaRG、HepG2細胞的24 h毒性曲線圖

表8 補骨脂素、異補骨脂素肝毒性線性方程及IC50值

3 結論

本實驗通過TCMSP數據庫查找補骨脂的主要成分并預測潛在的靶點，構建潛在靶點網絡圖。利用數據庫和文獻檢索共預測到了9個主要成分以及58個分子靶點，并通過GO生物學過程富集分析以及KEGG代謝通路富集分析其可能的生物學過程和生理功能，發現補骨脂能夠導致線粒體損傷而破壞細胞功能。同時，我們利用HepaRG、HepG2肝細胞系對補骨脂素及異補骨脂素的肝毒性作用進行了初步研究，證明其具有明顯的肝毒性。

4 討論

網絡藥理學是一門基于經典藥理學、計算機技術、生物信息學等多學科技術交叉、融合而發展起來的新興學科，是從分子、細胞再到組織、器官等多種水平來研究藥物與人體之間相互作用及其規律和本質的一種研究方法。將實驗數據和理論計算相結合，快速篩選有效的藥物分子及靶點，預測藥物可能存在的毒理作用及其機制，從而達到通過調控細胞內的復雜生物網絡來提高藥效、降低不良反應和治療疾病的目的［8］。本實驗通過網絡藥理學研究方法找到補骨脂損傷線粒體的靶點及通路，為后續的實驗提供理論依據。

通過中醫藥系統藥理學數據庫分析平臺得到補骨脂的主要活性成分，并將這些有效物質對應的潛在基因靶點輸入到String網站中建立補骨脂活性成分預測靶點的相互作用網絡（PPI）。由網絡關系圖我們發現，關系圖中央的幾個潛在基因相互作用更緊密。AKT1、HMOX1、BCL2L、AR、MAPK3、MAPK9等主要參與細胞的增殖與分化，對細胞起保護作用。利用DAVID數據庫對節點進行GO富集及KEGG通路分析，結果發現，這些靶點參與的生物學過程都與線粒體密切相關，而肝臟的功能依賴于線粒體的代謝穩態［9］。隨后我們將補骨脂活性成分的預測靶點與致線粒體損傷疾病靶點進行分析發現，在這58個目標靶點中有19個基因與線粒體損傷有關，這些靶點主要影響細胞氧化還原、細胞對缺氧的反應、調控線粒體膜的通透性、細胞線粒體細胞色素C的釋放等。

線粒體損傷是藥物性肝損傷的一個重要環節，線粒體能夠影響整個肝細胞的正常功能。藥物可以通過氧化應激、鈣離子紊亂、減少生物合成、改變線粒體膜的通透性、DNA突變等方式來損傷線粒體，從而進一步損傷肝細胞［10］。除此之外，內質網應激也能引起線粒體功能失調并加劇線粒體活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的產生，內質網應激與氧化應激不僅能通過各自的應激反應通路使細胞發生損傷，還可以通過線粒體途徑干擾細胞的功能，并激活促凋亡等信號通路引發細胞凋亡。在補骨脂的分子靶點中，其中Bcl2-Bcl2L信號通路與線粒體凋亡密切相關。在正常情況下，機體中的CHOP蛋白含量比較低，當細胞內外各種不利因素打破細胞內環境穩態，導致發生細胞應激反應時，CHOP蛋白就會大量表達，從而激活多條細胞凋亡通路，促使細胞膜的通透性發生改變，誘發細胞內Ca2+平衡紊亂，從而激活Bcl-2基因，觸發細胞線粒體途徑凋亡［11］。大量文獻報道，線粒體途徑是細胞凋亡中較為重要的一個環節。正常情況下細胞色素C存在于線粒體內部，當凋亡信號刺激時，活化的Bcl-2蛋白家族誘導細胞色素C從線粒體中釋放，該蛋白從線粒體中釋放到細胞胞質中，與caspase-9酶原結合，分解并活化caspase-9，激活的caspase-9活化下游的caspase-3，引起一系列caspase級聯反應，分解DNA導致凋亡反應，誘發細胞凋亡［12］。這說明補骨脂的活性成分能夠損傷線粒體，由于線粒體自身缺少修復能力［13］，故極其容易發生突變位點，導致線粒體在功能上有嚴重的損壞。

綜上所述，本文利用網絡藥理學并結合實驗驗證證實，補骨脂的活性成分可以導致肝損傷，而其機制與破壞線粒體的功能密切相關。實驗結果也表明其中的2個主要活性成分補骨脂素與異補骨脂素均可導致肝損傷，更好地驗證了網絡藥理學的結果，為以后臨床應用補骨脂及其含有補骨脂的中成藥應該考慮對肝臟的影響，從而更好地監測病人的藥物不良反應，保證病人的用藥安全。