2株源于紅樹林具有黑曲霉抗性細菌的篩選及發酵條件優化

阮羽萱 鄭添鵬 魏寶陽 劉博宇 阮穎 黃勇

摘要：黑曲霉（Aspergillus niger）是一種常見的病原微生物，極易造成糧食霉變、果實腐爛等問題，產生的毒素嚴重危害人體健康。紅樹林作為一種特殊的生態系統，具有重要的微生物學資源與經濟價值。首先采用常規細菌篩選方法分離菌株，通過觀察形態特征以及16S rRNA基因序列進行鑒定。然后通過單因素試驗并結合正交試驗確定菌株 Z-2001、R-2008生長的最佳培養條件，并通過拮抗試驗確定Z-2001、R-2008菌株對黑曲霉的抑制效果。發現 Z-2001、R-2008菌株最佳基礎培養基為營養瓊脂培養基（NA）。Z-2001菌株最佳培養基配方為葡萄糖（2.0%）+蛋白胨（0.8%）+MgSO4·7H2O（0.30%）+牛肉膏（0.3%）+NaCl（0.5%），最佳pH值、溫度、轉速分別為8、37 ℃、210 r/min，黑曲霉抑菌率為76.80%。R-2008菌株最佳培養基配方為葡萄糖（2.0%）+酵母粉（2.4%）+MgSO4·7H2O（0.20%）+牛肉膏（0.3%）+NaCl（0.5%），最佳pH值、溫度、轉速分別為8、28 ℃、180 r/min，黑曲霉抑菌率為78.70%。結果表明，Z-2001、R-2008菌株能夠有效抑制黑曲霉生長，且對生長環境以及條件要求并不嚴苛，具有較好的開發前景。

關鍵詞：紅樹林;芽孢桿菌;抗性細菌;黑曲霉;培養基優化

中圖分類號：S182;S188+.4 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0133-08

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種重要的植物病原菌，廣泛分布于糧食、植物性產品和土壤中，極易大量繁殖導致糧食霉變。據聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）統計，全世界每年大約有3%的糧食因為霉變而不能食用。霉菌腐敗是危害糧食安全儲藏的關鍵因素[1]。黑曲霉能夠導致劍麻莖腐病、棗果霉爛病、采后芒果果腐病、花生冠腐病、藍莓及冬葡萄果實腐爛、灰棗果實病害等植物病害[2-3]，由此看來，黑曲霉的防治尤為重要。研究發現，從陸地向海洋逐漸過渡的紅樹林生態系統蘊藏著大量的生物資源，張起暢等在東寨港紅樹林淤泥中檢測出53個門、909個屬的微生物類群[4]，具有巨大的經濟價值[5]。紅樹林具有的鹽漬化、強酸性、沼澤化等特殊的生態環境，使生長于此的微生物種群及其代謝產物等都具有一定的特異性。目前已知紅樹林微生物中有許多菌株能夠產生具有生物活性的抗性物質，其產物肽類化合物、酯類化合物、胞外多糖等已廣泛應用于抗生素、免疫抑制劑、蛋白黏合抑制劑、食品添加劑的研制等方面[6-7]。鄭紅蕓等在廣西茅尾海紅樹林根圍淤泥中發現了具有金黃色葡萄球菌抗性的3株鏈霉菌[8];Chi等發現了28株對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albican）和新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）有抑制作用的紅樹林真菌[9]。雖然紅樹林微生物資源豐富，發現的抗性菌種類、數量日益增多，但少見黑曲霉拮抗的微生物的報道。

目前對黑曲霉的防治主要有物理處理法和化學殺菌法，但這些方法在一定程度上會對食物本身或人體造成危害。近年來，生物抑菌劑因其低風險、低成本和高效率等特點已成為當今確保食品安全生產的主流方式，應用前景日趨廣泛[10]。黑曲霉的生物防治主要集中在植物提取物或抗生素等方面，如茶樹精油中的α-松油醇、萜烯-4-醇，冬青油所含的水楊酸甲酯、肉桂與山蒼子復合精油均可有效抑制黑曲霉生長[11-13]，黃曲霉毒素B1（AFB1）能夠高效降解黑曲霉[14]。然而，目前發現的具有黑曲霉抑制作用的拮抗細菌較少，解淀粉芽孢桿菌CP 2014 無細胞提取液有明顯抑制效果[15]，Paenibacillus sp. 512、Brevibacterium sp. 90 等能夠有效防治黑曲霉引起的莖腐病[16]，而食品領域尚未見報道。

本研究從深圳壩光紅樹林海泥中分離鑒定出2株對黑曲霉具有顯著抑制效果的細菌，可能為新菌株，對其進行培養條件優化并確定了抑菌效果。研究結果可為充分利用紅樹林微生物資源、制備有效黑曲霉防治生物抑菌劑提供重要資料，具有較好的理論意義與應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集點的概況 樣品的采集點位于深圳壩光紅樹林（114°30′E 、22°39′N），地處深圳市東部龍崗區銀葉樹（Heritiera littoralis Dryand）濕地公園，此地位置偏遠，人為破壞與污染較少，附近海灘淺，相對封閉，水土一直保持較好[17]。該地區其他動植物、微生物資源豐富，具有較高的科研價值，是紅樹林生態系統研究的理想基地。試驗材料于2018年6月采集，全部試驗工作均在作物表觀遺傳調控與發育湖南省重點實驗室完成。

1.1.2 主要培養基 Luria-Bertani培養基（LB）、牛肉膏蛋白胨培養基（ND）、酵母液體培養基（YEB）、營養瓊脂培養基（NA）、營養肉湯培養基（NB）、馬鈴薯培養基（PDA）。

1.1.3 主要試劑 DNA聚合酶、dNTPs和引物，均購自湖南擎科生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR 儀，購自Bio-Rad 公司;紫外可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 海泥微生物多樣性研究及抗菌活性的篩選 取少量海泥勻漿樣品，在無菌試管中進行常規10倍梯度稀釋，從10-5、10-6、10-7 等3個濃度梯度樣品分別取200 μL稀釋液，分別涂布于LB、NA、PDA、ND固體分離培養基上，37 ℃培養2～3 d后，從平板中挑取典型菌落利用三區劃線法接種于對應的分離培養基上，獲取純單菌株。挑選已成熟的菌株接種在發酵培養基中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養2 d。選取革蘭氏陰性菌2株[大腸桿菌和變形桿菌（Proteus vulgaris）]，革蘭氏陽性菌3 株[枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌（Sarcine luted）和金黃色葡萄球菌]，真菌1株（黑曲霉）作為敏感指示菌，采用瓊脂擴散法[18]進行抗菌活性篩選。設置3個重復組，培養1～2 d，測量抑菌圈直徑，比較抗菌活性。

1.3.2 菌株的觀察與鑒定 將菌株Z-2001、R-2008接種于LB培養基上，觀察并記錄菌落的各項狀態，芽孢染色后在光學顯微鏡下觀察并記錄其結果。采用常規方法提取基因組[19]，利用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，產物由湖南擎科生物技術有限公司測序。測序結果用MEGA 7.0構建系統進化樹。

1.3.3 菌株培養條件的優化

1.3.3.1 菌株基礎培養基的篩選

將活化后的菌株接種于LB液體培養基中制成種子液。選用LB、PDA、YEB、NA、NB作為基礎培養基，將等量的種子液分別接種于液體基礎培養基中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養，定期檢測培養液D600 nm并比較結果。

1.3.3.2 菌株生長曲線的測定

挑取活化后的菌株，接種于基礎液體培養基中，培養方法同上，無菌環境下每隔2 h取樣1次，檢測培養液的D600 nm連續測量24 h，繪制生長曲線。

1.3.3.3 培養基組分種類及濃度優化

以NA為基礎培養基，研究不同碳源（葡萄糖、木糖、淀粉、蔗糖），氮源（酵母粉、蛋白胨、NH4NO3、KNO3），無機鹽（NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4+K2HPO4（1 ∶1）復合鹽、ZnSO4·7H2O）的培養效果。接入3%種子液（3個重復），培養及測量方法同上，篩選出最佳培養基組合[20]。在此基礎上研究碳源（0.10%、0.20%、0.25%、0.40%、1.00%、2.00%），氮源（0.3%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%），無機鹽（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）濃度對菌株培養效果的作用，獲得最優組分濃度。進而采用3因素3水平L9（33）進行正交試驗，以此確定培養基中各組分的最佳配比[21]。

1.3.3.4 發酵條件的優化

根據培養基優化結果，通過控制初始pH值（6、7、8），溫度（28、37、46 ℃），轉速（150、180、210 r/min）進行搖瓶發酵，獲得最佳初始發酵條件。

1.3.4 菌株的抑菌效果 在超凈工作臺上，挑取活化后的單菌落接種于最佳配比液體培養基中，按照“1.3.3”節方法培養12 h，制成種子液。將得到的菌液離心，過濾后留取濾液。分別按照2、4、6、8 mL的濃度梯度，加入到PDA固體培養基中混勻，再將等量黑曲霉接種于PDA平板中間，設置3組重復，28 ℃恒溫培養。每天觀察并記錄數據，根據公式算出抑菌率。

菌落生長抑制率=（對照生長直徑-處理生長直徑）/對照生長直徑×100%。

2 結果與分析

2.1 抗性菌的篩選

本研究運用4 種分離培養基對采集的海泥進行微生物分離，最終獲得58 株純培養物。并用濾紙片法[22]初篩分離的58 株菌株的抗菌活性，除去試驗過程中平板被污染以及其他原因無法得到測試結果的，發現有14 株菌株的發酵液至少對其中1 株敏感指示菌有不同程度的拮抗作用。在對獲得的14 株具有拮抗作用的菌株進行復篩時，發現其中有2 株菌株（Z-2001、R-2008）的發酵液對黑曲霉具有較強的拮抗作用。

2.2 Z-2001、R-2008菌株的鑒定

由表1、圖1可知，Z-2001、R-2008菌株二者形態相似，均為芽孢桿菌，呈革蘭氏陽性。根據測序結果和進化樹（圖2）分析顯示，Z-2001、R-2008與已知菌親緣關系較遠，可能為新種。

2.3 Z-2001、R-2008菌株培養基的單因素優化

由圖3可知，Z-2001、R-2008均在NA培養基上生長效果最佳，因此選用NA培養基作為后續研究的基礎培養基。在連續的24 h內每2 h測定1次菌液濃度，并繪制生長曲線。由圖4可知，在基礎培養基上Z-2001、R-2008的生長曲線均為典型的“S”形曲線，并且都在12 h左右達到生長量的高峰。

由圖5可知，Z-2001、R-2008菌株對葡萄糖的利用能力最強，其次是淀粉。因此筆者所在課題組選用葡萄糖作為發酵培養基中的最佳碳源。選取5個梯度探究葡萄糖質量分數對菌株生長的影響，當葡萄糖質量分數為1.00%時，Z-2001、R-2008菌體生長量最大，D600 nm值分別為1.981、2.044。因此發酵培養基中葡萄糖的最佳質量分數為1.0%。

由圖6可知，選取酵母粉、蛋白胨、KNO3、NH4NO3 4種氮源進行篩選，發現蛋白胨和酵母粉作為氮源時菌體的生長情況明顯優于其他氮源，說明Z-2001、R-2008菌株對有機氮源的利用能力更強。原因可能在于有機氮源中還包含著碳源和少量無機鹽，而無機氮源成分相對簡單，可能營養不足。因而分別選用蛋白胨、酵母粉作為Z-2001、R-2008 菌株發酵培養基中的最佳氮源。選取6個梯度探究蛋白胨、酵母粉對菌株生長的影響，發現 Z-2001 菌株的D600 nm值隨著蛋白胨質量分數的增加呈先上升后下降的趨勢。當蛋白胨質量分數達到0.8%時D600 nm值達到峰值，隨后開始緩慢下降，從而確定蛋白胨的最佳質量分數為0.8%。R-2008菌株的 D600 nm值在酵母粉質量分數為0.3%～1.0%之間變化不大，當達到1.2%時D600 nm值達最大值：1.942，之后D600 nm值開始緩慢下降。因此酵母粉的最佳質量分數為1.2%。

由圖7可知，選取NaCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O以及KH2PO4+K2HPO4（1 ∶1）復合鹽進行無機鹽篩選。除了鋅離子以外，其他離子都能夠促進Z-2001、R-2008菌株的生長，相比之下鎂離子作用較為明顯，因此2種菌生長的最佳無機鹽為MgSO4·7H2O。選取4個梯度探究最佳無機鹽離子質量分數，Z-2001、R-2008菌株的D600 nm值隨MgSO4·7H2O質量分數的增大呈現先上升后下降的趨勢。對于Z-2001菌株來說，鎂離子質量分數達到0.3%時，菌體的生長量處在較高的水平，D600 nm值也達到了最大值。而R-2008菌株則是在MgSO4·7H2O質量分數處于0.4%時達到生長最高水平。此結果與孔高飛對短小芽孢桿菌的研究結果[23]相似，因此Z-2001菌株的最優無機鹽MgSO4·7H2O最佳質量分數為0.3%，R-2008為0.4%。

2.4 正交試驗結果分析

由以上試驗得到了單因素的結果，而這些組分組合在一起可能會相互影響，導致培養效果變差，因此需要正交試驗來確定各組分配比，正交試驗因素和水平見表2。由表3可知，影響Z-2001菌株菌體生長的因素主次順序為MgSO4·7H2O>葡萄糖>蛋白胨，影響R-2008菌株菌體生長的因素主次順序為酵母粉>葡萄糖>MgSO4·7H2O。由正交試驗結果可以看出，Z-2001與R-2008最佳組合分別為A3B3C2、A3B3C2，而由均值得到的最佳組合分別為A3B2C2、A3B3C1。對這2種情況分別進行試驗，結果如圖8所示。因此Z-2001菌株菌體的最適培養基為葡萄糖2.0%、蛋白胨0.8%、MgSO4·7H2O 0.30%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%;R-2008 菌株菌體的最適培養基為葡萄糖2.0%，酵母粉2.4%，MgSO4·7H2O 0.2%，小牛浸膏0.3%，NaCl 0.5%。

2.5 菌株發酵條件的單因素優化

由圖9-A可知，隨著pH值的不斷增大，Z-2001、R-2008菌株的D600 nm值也隨之增大，在pH值=8時達到了最大值。說明Z-2001、R-2008 菌株在弱酸性和中性條件下可以生長，但偏堿性條件更適宜生長，因此選擇pH值=8為 Z-2001、R-2008 菌株的最適pH值。

溫度是影響細菌生長的一個重要因素，它能夠影響菌體代謝過程中酶的反應效率。由圖9-B可知，Z-2001、R-2008菌株在46 ℃培養時菌體中的酶因為溫度過高而逐漸失活，菌體生長量明顯變小，D600 nm值急劇下降，因此在高溫條件下并不適合Z-2001、R-2008的菌株生長。而Z-2001、R-2008 菌株分別在37、28 ℃時長勢良好，D600 nm值達到了最大。因此筆者所在課題組選擇 37 ℃作為 Z-2001 菌株的最適溫度，28 ℃作為R-2008菌株的最適溫度。

在搖床的振蕩培養下能夠使氧氣較多地進入培養液以供菌株使用，由圖9-C可知，Z-2001、R-2008 菌株分別在轉速為210、180 r/min時D600 nm值最大。因此筆者所在課題組選擇210 r/min為Z-2001菌株的最佳轉速，180 r/min為R-2008菌株的最佳轉速。

2.6 黑曲霉抗性

將過濾后的2種菌液以不同含量與PDA培養基混合制成帶藥培養基，再將等量黑曲霉接種在平板中央，測定2種菌對黑曲霉的抑制率。由圖10可知，隨著發酵液量的不斷增加其抑制效果逐漸顯現，特別是菌液量在6 mL時抑制效果變得明顯，8 mL 時基本可以抑制住黑曲霉孢子的生長。Z-2001 菌株8 mL的發酵液對黑曲霉的抑菌率可達到76.80%，R-2008菌株8 mL抑菌率可達到78.70%。

3 討論與結論

黑曲霉是世界衛生組織認定的一類病原微生物，對人體安全、食品安全產生了極大的威脅。目前，紅樹林是已知生態系統中種類豐富，高利用率的濕地生態系統之一[24]，蘊含著優質的微生物資源，許多微生物能產生大量有拮抗活性且效果明顯的代謝物質。在現行有效的黑曲霉防治方法中，生物法具有物理、化學法無法比擬的低投資、低風險、高效率、高收益等優勢。且生物法中大多利用的是植物與微生物，對環境友好且不會產生較大危害。許多植物提取物中含有重要的生物活性物質，已有研究表明肉桂提取液、丁香提取物對黑曲霉均有較強的抑制作用，肉桂抑菌圈直徑可達17.49 mm，丁香抑菌率可達50%[25-26]。本研究中，芽孢桿菌 Z-2001、R-2008最大抑菌率分別可達76.80%、78.70%，相比之下優勢明顯，且經過試驗，2種菌株大量培養所需條件簡單，可以認為其具有生物抑菌劑的開發價值。

微生物的抑菌機制較為復雜，一般認為芽孢桿菌發酵產生的拮抗活性物質主要包括由核糖體組成的化合物和由非核糖體組成的化合物這兩大類[27-28]。這些具有拮抗活性的物質能夠使菌絲生長受阻，產生畸形或推遲分生孢子的萌發時間，導致其芽管和菌絲畸形而不能繼續生長，從而實現拮抗作用[29]。本研究發現，芽孢桿菌Z-2001、R-2008代謝產物對黑曲霉拮抗效果顯著，但關于2種菌株抑制黑曲霉的有效成分、作用機制尚不清楚，需要進一步研究。

Z-2001、R-2008菌株為芽孢桿菌屬，培養條件簡單、成本低。菌株代謝產物能有效抑制黑曲霉菌絲生長，抑菌作用顯著，最高抑菌率分別達到76.80%和78.70%。研究結果可為生物抑菌劑的工業化生產提供理論依據，也可為后續深入研究奠定基礎。

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