超聲波處理影響玉米種子活力的轉錄組分析

劉鵬飛， 李坪遙， 劉 君， 麥嘉埼， 周捷成， 梁日朗， 蔣 鋒

(1.仲愷農業工程學院農業與生物學院， 廣州 510225；2.廣州市特色作物種質資源研究與利用重點實驗室， 廣州 510225)

玉米是我國的主要糧食作物，在國民經濟發展中具有舉足輕重的地位[1]。我國玉米播種的區域跨度和地方氣候差異較大，而高活力種子可有效減少不良環境和有害微生物對種子的影響，保證苗齊苗壯，對確保作物產量十分必要[2]。因此，高活力的玉米種質資源是玉米產業發展的重要需求。

超聲波是一種綠色無污染的物理處理手段，目前研究表明，適度超聲波處理可提高種子發芽率，促進種子萌發和生長[3-11]。黎國喜等[12]研究發現，超聲波處理過的水稻種子，其促進種子活力的效應可以延續到水稻后期生長發育及產量。陳曉輝等[13]發現，超聲波處理可以顯著促進玉米種子的萌發；吳海燕[14]研究發現，超聲波處理不僅能促進玉米種子萌發，而且能顯著促進玉米植株的生長發育，提高株高、莖粗、葉長和葉寬，利于光合產物的產生和積累。轉錄組廣義上指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合[15]。關于種子活力的相關轉錄組分析已在水稻[16]、花生[17]、黃芪[18]等植物方面有相關報道?；谵D錄組測序技術，對玉米在高溫脅迫、鹽脅迫、根系耐旱性[19-24]等逆境條件下的基因調控及差異基因表達等方面也有一定的研究。目前，超聲波在種子活力上的研究大都集中在超聲波對種子萌發、生長發育及產量因素的影響，通過測定與種子活力相關的表型性狀及生理生化指標等來揭示超聲波處理對種子活力的影響[25-27]。

目前針對超聲波促進種子活力的機理研究較少，尤其是分子機理研究方面鮮有報道。本研究通過超聲波處理方法，對糯玉米自交系N 51種子進行不同時長處理，分析不同處理時長對玉米種子活力的影響及規律。通過轉錄組學分析超聲波處理下玉米種子與活力相關的差異表達基因以及通過GO數據庫注釋和KEGG數據庫分析，為解析超聲波處理促進種子活力及相關分子機理研究提供一條探究之路。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試玉米材料來源于廣州市嶺南特色作物種質資源研究與利用重點實驗室自主選育的糯玉米(ZeamaysL.sinensisKulesh)自交系N 51。選取籽粒飽滿且大小一致的種子作為試驗材料。

1.2 處理及取樣

取糯玉米種子清水浸泡12 h后放入超聲波清洗儀(KQ 3200 E型，40 kHz，150 W)中，分別處理5 min(T 1)、10 min(T 2)、15 min(T 3)，以未經超聲波處理的玉米種子即處理0 min作為對照(ck)。處理結束后放入人工氣候箱(恒溫28 ℃，16 h光照，8 h黑暗)中進行發芽試驗，設3次重復，每次重復50粒。

以種子露白為萌發標準，從24 h后開始每隔12 h記錄種子的萌發數，直至對照組種子萌發結束。試驗過程中，篩選種子萌發率差異顯著的超聲波處理時長，并基于種子萌發差異顯著的時間點進行取樣，進行轉錄組測序分析。

萌發率(%)=(種子萌發數/供試種子數)×100%；

萌發速率為每12 h增加的萌發種子數，指標測定3次取平均值。

1.3 轉錄組測序

對玉米樣品進行總RNA的提取、mRNA的富集、文庫構建和質檢。質檢合格后開始進行轉錄組測序分析, 測序工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。首先對原始數據進行質控，過濾低質量數據，留取高質量的序列片段進行后續分析。將留取的高質量的序列片段與玉米的核糖體數據庫進行對比，去除比對上核糖體的序列片段，保留未比對上的序列片段。隨后將未比對上的序列片段對比到玉米參考基因組：Zeamays.B73_RefGen_v4進行比對分析；根據比對結果，利用Stringtie重構轉錄本，并利用RSEM計算每個樣本中所有基因的表達量，獲得序列的表達量數據和歸一化校正后的基因表達量FPKM值，基于各樣本表達量結果，通過PCA分析和計算樣本間pearson相關系數，考查樣品之間重復性?；诨虮磉_水平分析中得到的序列片段的表達量數據，利用DESeq 2軟件對數據進行組間差異分析，基于差異分析結果，篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因用于后續分析。利用GO數據庫和KEGG數據庫對差異基因的功能和信息進行分析和挖掘。

2 結果與分析

2.1 不同時長超聲波處理對玉米種子活力的影響

對不同時長超聲波處理玉米種子的萌發試驗結果表明，以0 min(ck)、5 min(T 1)、10 min(T 2) 和15 min(T 3)共4個時長對玉米種子進行處理，各處理組的萌發率均高于ck且各處理組間萌發率具有差異，其中10 min時長處理的效果最好，萌發率最高，種子在36 h時萌發生長差異最顯著(如圖1)。ck、T 2和T 3處理下，糯玉米自交系N 51種子活力呈先上升和后下降的趨勢。

注：ck表示對照組(未進行超聲波處理)，T 1表示超聲波處理5 min，T 2表示超聲波處理10 min，T 3表示超聲波處理15 min。圖1 玉米種子在不同超聲波時長處理下不同時間的發芽率Fig.1 The germination rate of corn seeds at different time under different ultrasonic durations

2.2 測序數據質量評估

本試驗對ck、T 2、T 3 三個處理共9個樣本進行轉錄組測序分析，獲得大量原始數據(Raw Reads)，篩選得到Clean Reads，隨后分析Clean Reads 的堿基組成及質量分布以及評估數據質量。結果顯示，每個樣品中的Clean Reads堿基質量為Q 20的堿基數目比例均高達97.6%以上，堿基質量為Q 20的堿基數目比例均高達93.4%以上，各生物學重復之間QC含量差異不大，而且所有樣品的QC含量均高于56.8%，表明過濾后的Clean Reads堿基識別準確度可靠，Reads質量高，可用于下一步分析。

2.3 Clean Reads序列比對分析

為避免rRNA殘留，將Clean Reads與玉米的核糖體數據庫進行比對，除掉比對上核糖體的Reads，獲得過濾rRNA后測序片段數(Unmapped Reads)，然后將Unmapped Reads與玉米參考基因組(Zeamays.B73_RefGen_v4)進行比對分析，結果顯示，測序所得數據利用率較高，有效Reads總比對率均達到89.94%以上，而且唯一比對上參考基因組的有效Reads所占比例高，均達到87.44%以上，多處比對上參考基因組的有效Reads比例很低，均不超過2.61%。同時每個樣品中至少89.90%的有效Reads均比對到外顯子區域。根據比對結果，利用Stringtie重構轉錄本，并利用RSEM計算每個樣本中所有基因的表達量和得到不同基因在樣本中的表達量，用于后續差異分析。

2.4 樣本相關性評估

本試驗通過計算皮爾遜相關系數r來衡量樣品間的相關性，根據Z-score繪制熱圖(圖 2)對不同樣品間的生物學重復相關性進行可視化分析，結果表明玉米的9個樣品中重復之間相關性高，不同處理間相關性低，可進行下一步分析。

2.5 差異基因篩選

36 h處理時，糯玉米自交系N 51種子萌發率在ck、T 2、T 3這3個處理間，呈先升后降的趨勢，故篩選出基因表達量呈現先升后降趨勢的基因857個以及先下降后上升趨勢的基因848個，記為Cluster 1和Cluster 2(圖 3)。

2.6 差異基因功能分析

對Cluster 1基因和Cluster 2基因進行GO功能注釋。發現Cluster 1基因(圖 4)在生物過程類別中注釋到21個亞類，主要注釋在細胞過程(425個)、代謝過程(401個)、單一生物過程(273個)中；在分子功能類別中注釋到了13個亞類，主要注釋在結合(360個)和催化活性(314個)；在細胞組成類別中注釋到了14個亞類，主要注釋在細胞(395個)、細胞組分(388個)和細胞器(295個)中。

Cluster 2基因(圖 5)在生物過程類別中注釋到了18個亞類，主要注釋在代謝過程(428個)、細胞過程(416個)和單一生物過程(295個)中；在分子功能類別中注釋到了13個亞類，主要注釋在催化活性(397個)和結合(370個)中；在細胞組成類別中注釋到了13個亞類，主要注釋在細胞(338個)、細胞組分(338個)和膜(277個)中。

對Cluster 1基因和Cluster 2基因進行GO富集分析，選取富集分析結果中FDR值最小的前20繪制GO term顯著富集柱狀圖(圖 6)，結果顯示，Cluster 1基因主要富集在葉綠體(GO：0009507)、質體(GO：0009536)、類囊體(GO：0009579)、葉綠體部分(GO：0044434)、質體部分(GO：0044435)、葉綠體類囊體(GO：0009534)、類囊體部分(GO：0044436)、質體類囊體(GO：0031976)、類囊體膜(GO：0042651)和光合膜(GO：0034357)等term 中。

Cluster 2基因(圖 7)主要富集在細胞外圍(GO：0071944)、細胞外區域(GO：0005576)、質膜(GO：0005886)、活性氧代謝過程(GO：0072593)、細胞多糖代謝過程(GO：0044264)、半纖維素代謝過程(GO：0010410)、胞間連絲(GO：0009506)、細胞結合(GO：0030054)、細胞間連接(GO：0005911)、共質體(GO：0055044)、過氧化氫分解代謝過程(GO：0042744)、細胞壁多糖代謝過程(GO：0010383)、氧化還原過程(GO：0055114)等term中。

注：ck表示對照組(未進行超聲波處理)；UL 1表示超聲波處理10 min；UL 2表示超聲波處理15 min。 圖2 9個玉米樣本的相關性熱圖 Fig.2 The correlation heat map of 9 corn samples

圖3 Cluster1和Cluster2基因表達模式 Fig.3 Cluster1 and Cluster2 gene expression pattern

對Cluster 1和Cluster 2基因顯著富集的term進行共富集分析，發現其共同顯著富集的term數是7個(圖 8)，分別是氧化還原過程(GO：0055114)、對氧化應激的反應(GO：0006979)、幼苗發育(GO:0090351)、對非生物刺激的反應(GO：0009628)、激素水平的調節(GO：0010817)、金屬離子結合(GO:0046872)和整體-[?；d體蛋白]合成酶活性(GO:0008897)。表明超聲波處理可能引起上述基因的差異表達調控，進而影響玉米種子活力相關性狀的表達。

對Cluster 1和Cluster 2基因進行KEGG富集分析，選取富集分析結果中FDR值最小的前20繪制KEGG顯著富集柱狀圖，富集結果分析顯示，Cluster 1(圖 9)主要注釋在光合作用(ko 00195)、蛋白質外排(ko 03060)、類胡蘿卜素的生物合成(ko 00906)、植物的晝夜節律(ko 04712)、谷胱甘肽代謝、(ko 00480)、卟啉和葉綠素代謝(ko 00860)、硫代謝(ko 00920)、光合作用-天線蛋白(ko 00196)、泛醌和其他萜類醌的生物合成(ko 00130)、次生代謝產物的生物合成(ko 01110)、植物激素信號轉導(ko 04075)、脂肪酸伸長率(ko 00062)、精氨酸生物合成(ko 00220)等通路中。

Cluster 2(圖 10)主要注釋在苯丙素的生物合成(ko 00940)、次生代謝產物的生物合成(ko 01110)、類黃酮生物合成(ko 00941)、氰氨基酸代謝(ko 00460)、植物激素信號轉導(ko 04075)、亞油酸代謝(ko 00591)、淀粉和蔗糖代謝(ko 00500)、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚的生物合成(ko 00945)、代謝途徑(ko 01100)、氮素代謝(ko 00910)、磷酸肌醇代謝(ko 00562)、抗壞血酸和海藻酸鹽代謝(ko 00053)、不飽和脂肪酸的生物合成(ko 01040)和谷胱甘肽代謝(ko 00480)等通路中。

圖4 Cluster1 GO注釋分類 Fig.4 Cluster1 GO annotation classification

圖5 Cluster2 GO注釋分類Fig.5 Cluster2 GO annotation classification

圖6 Cluster1 GO富集分析Fig.6 Cluster1 GO enrichment analysis

圖7 Cluster2 GO富集分析Fig.7 Cluster2 GO enrichment analysis

對兩個趨勢基因集注釋到的KEGG通路進行聯合分析，發現共富集到34個通路(圖 11)，分別為苯丙烷生物合成、次生代謝產物的生物合成、黃酮類生物合成、氰氨基酸代謝、植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝、代謝途徑、氮素代謝、磷酸肌醇代謝、谷胱甘肽代謝、MAPK信號轉導途徑-植物、精氨酸生物合成、植物與病原體的相互作用、磷脂酰肌醇信號系統、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、醚脂質代謝、氨基酸的生物合成、泛醌和其他萜類醌的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、過氧化物酶體、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、蛋白質出口、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、晝夜節律-植物、光和生物中的碳固定、乙醛酸和二羧酸酯代謝、甘油酯代謝、吞噬體、泛素介導的蛋白水解、碳代謝、內質網中的蛋白質加工。表明響應超聲波處理的差異基因通過影響糯玉米自交系種子的上述通路來促進種子萌發，提高種子活力。

圖9 Cluster1 KEGG富集分析Fig.9 Cluster1 KEGG enrichment analysis

圖8 Cluster 1和Cluster 2共富集的GO termFig.8 GO term co-enriched by Cluster 1 and Cluster 2

3 討論與結論

采用超聲波處理玉米種子并對顯著影響種子活力的處理進行轉錄組測序分析，該數據反映了經超聲波處理后玉米種子萌發生長過程中基因差異表達情況，通過對差異基因的表達和功能分析，探索響應超聲波處理后種子活力相關基因的表達調控，為超聲波對玉米種子活力的影響以及其相關分子機制的研究提供一定的參考。本研究通過對糯玉米自交系N 51進行不同時長的超聲波處理，發現超聲波處理5 min、10 min和15 min的種子萌發率均高于未進行超聲波處理，其中10 min和15 min差異達到顯著水平，這與陳曉輝[13]和吳海燕[14]的研究結果相似，表明超聲波處理可以提高玉米種子的活力。

轉錄組測序分析篩選得到兩個與種子萌發率在不同處理中呈現出趨勢一致的共表達模式基因集Cluster 1(857個基因)和Cluster 2(848個基因)。通過GO功能注釋和共富集分析，得出Cluster 1和Cluster 2基因集注釋到生物過程、分子功能和細胞組成三個大類的共92個亞類，分別富集在氧化還原過程、對氧化應激的反應、幼苗發育、對非生物刺激的反應、激素水平的調節、金屬離子結合和整體-[?；d體蛋白]合成酶活性這7個過程中。研究表明，植物激素在種子萌發過程中起到顯著作用[28-29]，本研究結果與之相似。對Cluster 1和Cluster 2基因集進行KEGG富集分析表明，它們參與了與代謝、細胞過程、有機系統、遺傳信息處理和環境信息處理相關的34條通路，其中與代謝相關的通路，如苯丙烷生物合成、次生代謝產物的生物合成、淀粉和蔗糖代謝、谷胱甘肽代謝、氨基酸的生物合成，已在小麥[30-31]和水稻[32]相關研究中表明與提高種子活力相關；與細胞相關的通路中的過氧化物酶體已在玉米[33]和擬南芥[34]中被證明可有效促進根的伸長和發育。這些與本研究中超聲波處理促進種子活力表達所影響的主要通路結果一致，表明這些通路在調控種子活力方面發揮了重要的作用。本研究對超聲波處理影響種子萌發時期的部分差異基因進行探索，而超聲波處理對玉米苗期生長、抗逆能力、生產潛力等多方面影響的相關基因的表達與調控還需要進一步深入挖掘。

圖10 Cluster2 KEGG富集分析Fig.10 Cluster2 KEGG enrichment analysis

圖11 Cluster1和Cluster2共富集的通路 Fig.11 Cluster1 and Cluster2 co-enrichment pathways