圓錐繡球“粉色精靈”組培快繁技術研究

王紅梅， 陳婷婷， 劉春風， 孟紫蓮， 高 鵬

(1.江蘇農林職業技術學院， 江蘇 句容 212400；2.北京林業大學生物科學與技術學院， 北京 100083)

圓錐繡球(HydrangeapaniculataSieb.et Zucc)是虎尾草科繡球屬植物，落葉灌木，多生于山谷、疏林或灌叢中[1]。葉片紙質，卵形或橢圓形，長6～12 cm，對生或輪生，背脈上具毛[2]；聚傘花序尖塔形，花序極大，如‘魔幻月光’品種花序縱徑可達30 cm以上?；ㄆ?—10月，觀賞期長，從夏季一直持續到秋季[3]。圓錐繡球品種豐富，顏色可人，多數品種初花時為白色或綠色，隨著溫度和光照條件等的變化，部分品種花色可變為純白、淡粉、綠粉、紅色等，因而具有極高觀賞價值[4]。圓錐繡球適應范圍較廣，可片植、孤植和群植于庭院、公園、街道等綠地，亦可多個品種混栽更為壯觀且延長了觀賞期[5]。初秋季節，花干而不枯，巨大的花球剪下可作為室內的裝飾點綴。此外，圓錐繡球還具有一定的藥用價值，其根系可入藥，用于免疫疾病的治療，如風濕性關節炎[6]；其提取物總香豆素苷對治療慢性損傷有一定作用[7]。由于圓錐繡球花序多由無性花組成，較難采用播種方法進行繁殖，多采用無性繁殖的方法，如扦插、壓條等，但繁殖率不高，而組培可以在短期內快速繁殖，獲得優質苗木[8]。

目前對于圓錐繡球的組織培養報道較少，陸乙卜等[9]以野生圓錐繡球的種子為試驗材料，研究了種子離體萌發的培養條件。王紅梅等[10]報道了圓錐繡球‘北極熊’組培快繁體系的建立?！胺凵`”是開花較早的圓錐繡球品種，且為少有的花色可變品種，初花白色，隨著開花時間的延長、溫度及光照條件的變化，可逐漸變為紅色，其植株粗壯，生長旺盛，是觀賞性與抗性均較好的品種。目前，“粉色精靈”組培快繁技術的研究未見相關報道[3]。本研究旨在利用莖段作為外植體，探索圓錐繡球“粉色精靈”的組培快繁技術，為利用組織培養的方法快速繁殖圓錐繡球健壯苗木提供一定的技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

外植體材料為圓錐繡球“粉色精靈”(Hydrangeapaniculata‘Pink Winky’)品種的當年生幼嫩莖段，來源于江蘇農林職業技術學院農博園科研基地。于4—6月份的晴天中午，選擇生長健壯、無病蟲害的新生嫩梢8～10 cm，采集完后立即將其放進裝水的燒杯中，以防嫩梢失水萎蔫，并及時帶回實驗室進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1材料預處理

將采集來的嫩梢進行修剪，去掉葉片和葉柄，剪切成2 cm左右莖段，每段保留1～2個腋芽[3]，然后將莖段放入干凈的燒杯中，在洗衣液中浸泡15 min，再在流水下沖洗1.5～2 h。

1.2.2材料表面滅菌

在超凈工作臺內將流水沖洗好的莖段用2 g/L多菌靈和0.6 g/L鏈霉素的混合溶液浸泡5～12 min，之后用無菌水沖凈[3]，然后用消毒好的鑷子每次夾取10個莖段，轉入無菌空瓶，用75%酒精處理40 s，無菌水沖洗2次，再用0.1%HgCl2處理3～10 min，無菌水沖洗3次，處理時不斷搖晃無菌瓶，使藥劑與材料充分接觸。采用雙因素完全隨機組合試驗設計，試驗因素分別為：殺菌劑2 g/L多菌靈和0.6 g/L鏈霉素混合溶液的處理時間(0、5.0、8.0、12.0 min)，HgCl2的處理時間(3.0、5.0、7.0、10.0 min)各4個水平，共16個處理，每個處理接種20瓶，每瓶接種2個外植體，重復4次[3]。14 d后觀察滅菌效果，統計污染率、褐化率和成活率。

1.2.3啟動培養

在超凈工作臺上，對經表面滅菌的莖段兩端直接接觸藥劑的切口稍做修剪，修剪成1 cm左右的單芽莖段，垂直接種于培養基上，接種深度以能固定住外植體莖段為宜。啟動培養選用MS基本培養基，采用雙因素完全隨機組合試驗設計對激素的種類及濃度進行試驗，分別為：6-BA(0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L)和NAA(0.1、0.15、0.2、0.5 mg/L)，共16個處理，每個處理15瓶，每瓶接種2個外植體，重復4次[3]。30 d后統計生長狀況并計算萌芽率。

萌芽率(%)=(萌芽外植體數/接種數)×100%。

1.2.4增殖培養

將經過啟動培養30 d的組培苗截成1.5 cm左右的帶芽莖段，將莖段下部可能接觸到培養基的部分葉片減掉，然后將修剪好的莖段接種到增殖培養基。增殖培養選用MS基本培養基，采用雙因素完全隨機組合試驗設計，加入不同濃度的6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.1、0.15、2.0 mg/L)，共9個處理，每個處理20瓶，每瓶接種2個外植體,重復3次。20 d后統計生長狀況并計算增殖系數。

增殖系數=總增殖芽數/原接種數[3]。

1.2.5生根培養

選用1/2 MS基本培養基，采用正交試驗設計，試驗因素及水平分別為6-BA(0、0.05、0.2 mg/L)，IBA(0、0.1、0.5 mg/L)，NAA(0.05、0.1、0.5 mg/L)，共9個處理，每個處理接種40個莖段，重復3次。接種方法為：待增殖培養20 d左右，試管苗長到2 cm以上時[11]，將較健壯的組培苗取出，剪掉基部愈傷組織及能接觸到培養基的葉片，垂直接種于生根培養基上，每瓶接種1～2個莖段，20 d后計算生根率、平均根數和平均根長。

注：不同字母表示在0.05水平上差異顯著。 圖1 不同處理對外植體消毒效果的影響 Fig.1 Effect of different treatments on the disinfection effect of explants

1.2.6馴化與移栽

將經過生根培養30～35 d，帶健壯根的組培苗在溫室進行馴化，兩周左右后可以看見組培苗的莖段變硬，打開瓶蓋，煉苗2 d，移栽前用溫水洗凈組培苗根系周圍的培養基，栽入由腐殖土、蛭石、珍珠巖配比好的3種基質中，共7個處理，每種處理30株。移栽后澆透水，用塑料薄膜覆蓋，溫度保持在25 ℃左右，空氣濕度保持在80%～90%，每天上午和下午視情況噴水2次，注意通風透氣，30 d后統計成活率。

1.2.7培養條件

啟動和增殖培養基中蔗糖濃度為30 g/L[3]，生根培養基中蔗糖濃度為20 g/L。其余條件均為：瓊脂6.8 g/L，pH值5.8～6.2。121 ℃高壓滅菌20～25 min，培養室中溫度為(25±2)℃，光照強度保持在2 000～3 000 lx，光照時間為每天12 h[3]。

1.2.8統計分析

采用IBM SPSS STATISTIC 23.0單因素方差分析(ANOVA)、一般線性模型(單變量、多變量)進行方差分析，采用Excel 2016軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 外植體的消毒效果

內源菌是導致組培過程污染率高的原因之一，因此需要借助一些殺菌劑進行殺菌。多菌靈為高效低毒內吸性殺菌劑，有內吸治療和保護作用[12]。鏈霉素是一種抗生素，有一定抗菌作用。將外植體浸入2 g/L多菌靈和0.6 mg/L鏈霉素混合溶液中，再配合酒精與HgCl2進行表面滅菌。外植體的消毒效果見表1。

利用SPSS軟件將百分數資料進行數據轉換，公式為：X2=ARSIN(SQPT(X1))，其中X1為需轉換的百分數(數值范圍為0～1之間)，X2為轉換后的數據。利用轉換后的數據進行方差分析和多重比較。將污染率、褐變率作圖，并在圖中以字母的形式標出多重比較結果。由圖1可見，處理10的污染率和褐化率均最低，分別為6.25%和0.63%。此時的殺菌劑滅菌時間為8 min，HgCl2滅菌時間為5 min。當殺菌劑滅菌時間小于8 min時滅菌效果不明顯，污染率高。當大于8 min時污染率又會增加。當HgCl2滅菌時間小于5 min時褐化率極低，但是污染率高，滅菌效果不明顯。當HgCl2滅菌時間大于5 min時褐化率增高，外植體受傷嚴重。

表1 外植體的表面消毒效果Table 1 Effect of surface disinfection of explants

2.2 激素種類及濃度對腋芽萌發的影響

初代培養30 d后對組培苗腋芽萌發情況做統計，統計數據及極差分析結果(見表2)。

從表2可得出，在其他因素相同的條件下，激素6-BA較NAA對腋芽的萌發影響更大，處理6，即當6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度為0.15 mg/L時萌芽率可達100%，且生長旺盛，苗的生長情況見圖2 A～圖2 C)。通過SPSS軟件對萌芽率百分數進行平均根反正弦轉換后，再進行方差分析，結果得出，6-BA濃度對腋芽誘導的影響p=0.000，小于0.05，所以處理間差異顯著；NAA濃度對腋芽誘導的影響p=0.022，小于0.05，所以處理間差異顯著。多重比較結果以字母的形式標注在表2各水平的平均數后，其結果得出：6-BA濃度為0.5 mg/L時與其他濃度間均存在顯著差異，且該濃度萌芽率最高，說明0.5 mg/L的6-BA對芽的分化效果最好。當NAA濃度為0.5 mg/L時與其他濃度間均存在顯著差異，其萌芽率低；而其他濃度間對腋芽誘導的效果差異不顯著。

表2 不同生長激素配比對腋芽誘導的影響的極差分析Table 2 Range analysis of effect of different growth hormone ratio on axillary bud induction

2.3 不同濃度生長激素配比對增殖效果的影響

增殖培養30 d左右，對增殖效果進行記錄并做極差分析，見表3。增殖系數是衡量植物分化能力的重要指標，是組培過程中需要著重研究的問題。增殖系數的大小決定了擴繁植株的數量，在組織培養試驗中尤為重要。通過試驗發現，當6-BA濃度為0.1 mg/L、NAA濃度為0.15 mg/L時，叢生芽最多且苗健壯，增殖系數可達7.0，苗的生長情況見圖2 D。

極差分析結果顯示，6-BA的第二水平與NAA的第二水平結合對不定芽增殖的效果最好。對不同濃度生長激素配比對增殖效果影響做方差分析及多重比較，結果顯示，不同濃度6-BA對增殖的影響p=0.016，小于0.05，所以處理間差異顯著；不同濃度NAA對增殖的影響p=0.012，小于0.05，所以處理間差異顯著。多重比較結果(以字母形式標注于表3)得出：當6-BA濃度為2.0 mg/L時與其他濃度間差異顯著，但增殖系數最低；而6-BA濃度為1.0 mg/L和1.5 mg/L之間差異不顯著。當NAA濃度為0.5 mg/L時與其他濃度間差異顯著，而NAA 0.10 mg/L和0.15 mg/L之間差異不顯著。綜合分析，適宜圓錐繡球“粉色精靈”增殖的培養基為：MS+6-BA(1.0～1.5)mg/L+NAA(0.10～0.15)mg/L。

表3 不同生長激素配比對增殖效果的極差分析Table 3 Range analysis of effect of different concentrations of growth hormone on proliferation

表4 不同生長激素配比對生根效果影響的極差分析Table 4 Range analysis of effect of different concentrations of growth hormone on rooting

注：A為莖段外植體腋芽萌發；B～C為初代培養苗；D為增殖培養苗；E～F為生根培養苗；G～H為移栽組培苗。 圖2 圓錐繡球“粉色精靈”的組織培養Fig.2 Tissue culture of Hydrangea paniculata ‘Pink Winky’

2.4 不同濃度生長激素配比對生根效果的影響

增殖培養20 d后對生根情況進行統計，統計數據及極差分析結果見表4。

對于生根率的影響排序為：IBA>6-BA>NAA；對于根數的影響排序為：IBA>6-BA>NAA；對于根長的影響排序為：6-BA>IBA>NAA。利用SPSS軟件對不同激素配比的生根效果進行方差分析及多重比較，其中生根率需進行平方根反正弦轉換后再分析。方差分析結果表明，無論是生根率、平均根數還是平均根長，6-BA、IBA、NAA的各水平間的p值均大于0.05，即各水平間差異不顯著。在試驗所選取的激素配比范圍內，圓錐繡球“粉色精靈”生根比較容易。但結合根的長勢以及葉片與植株的生長情況分析，未添加6-BA的處理，植物葉片枯黃；IBA不添加時，根細弱，隨著加入量增加，對根的生長有促進作用；當NAA濃度較低時，不易生根，濃度較高時，莖基部愈傷組織增大，并萌生出粗壯根系。所以由表4可知，當6-BA濃度為0.05 mg/L，IBA濃度為0.1 mg/L，NAA濃度為0.2 mg/L時，3種激素相互協作，效果最好，生根率為100%，平均根長為3.12 cm，平均根數21條，根系發達，苗健壯，見圖2 E、圖2 F。

2.5 不同基質體積配比對后期馴化移栽效果的影響

移栽之后統計移栽苗的成活率(見表5)，對成活率數據進行方差分析及多重比較。由此可得，當基質配比為V腐殖土∶V珍珠巖=1∶1時，成活率最高為87%，見圖2 G、圖2 H。

表5 不同基質體積配比對后期馴化移栽效果的影響Table 5 Effects of different volume ratio of substrate on the later domestication and transplanting

3 結論與討論

3.1 結 論

在圓錐繡球“粉色精靈”的組培試驗中，通過數據對比得出最佳的滅菌方法為：將處理好的外植體在洗衣液中浸泡15 min，流水下沖洗1.5～2 h，2 g/L多菌靈和0.6 g/L鏈霉素浸泡8 min左右，用無菌水沖凈，將莖段放入超凈工作臺進行表面消毒，75%酒精浸泡1 min左右，無菌水沖洗1～2次，0.1%HgCl2浸泡5 min左右，無菌水沖洗3～5次，成活率達95%。著重解決啟動培養時外植體污染率極高的問題。在初代培養過程中，當MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L，萌芽率達100%，組培苗健壯，葉片大。在增殖培養過程中，當MS+6-BA(1.0～1.5)mg/L+NAA(0.10～0.15)mg/L+瓊脂6.8 g/L+蔗糖30 g/L，增殖系數最高可達7.0，解決了增殖培養中增殖系數不高等問題。生根培養過程，培養基為1/2 MS+6-BA 0.05 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，附加瓊脂6.8 g/L，蔗糖20 g/L，生根率達100%，根長3.12 cm。在后期馴化與移栽階段，使用V腐殖土∶V珍珠巖=1∶1，成活率可達87%。通過上述研究建立相對合適的快繁體系，降低污染率，提高繁殖率及生根率，改善組培苗生長狀況，為利用組織培養的方法快速繁殖圓錐繡球苗木提供技術支持。

3.2 討 論

植物組培試驗是一個不斷嘗試的過程，在此過程中尋找對外植體的最佳滅菌藥劑、滅菌時間、滅菌方法尤為重要，是實現組培試驗的關鍵步驟。解決外植體污染問題是組培的首要任務。微生物是引起植物組織培養污染的重要原因[13]，而其小又無處不在，所以減少培養環境中的微生物可以大大提高組培效率[14]。外植體的滅菌是組培的關鍵，外植體的不同生長狀態，不同采集時間，表面微生物情況不同，甚至有些菌絲體已侵入組織[15]，使消毒滅菌效果差異較大。單一的藥劑滅菌很難達到較好的效果，利用抑菌劑或殺菌藥劑對材料進行處理后，再利用酒精和HgCl2配合進行表面消毒滅菌的效果明顯好于不使用殺菌劑的滅菌處理，但若殺菌劑浸泡時間超過一定臨界值，滅菌效果也不明顯。HgCl2浸泡時間過短，滅菌不充分，時間過長會導致外植體褐化。

在啟動、增殖、生根培養過程中，尋找最合適的激素配比平衡對組培苗的生長影響顯著。在啟動培養過程中，細胞分裂素6-BA對芽的誘導效果顯著，不過隨著濃度的升高，超過臨界值會有一定抑制作用，培養基中使用細胞分裂素與生長素配合，對于芽的誘導及高生長都有顯著的影響。增殖培養過程中，較高的6-BA濃度會抑制芽的伸長[16]，后期葉片會枯黃；NAA濃度過高會抑制苗的分化[17]，使基部愈傷組織膨大。后期葉片枯黃問題可添加20～25 g/L的香蕉泥來解決，在之后的組培試驗中，可繼續進行相關研究。添加一定濃度NAA與IBA能促進組培苗根系數量增多和根的生長[18]。IBA和NAA協同作用時，效果遠遠大于其中任一種激素單獨使用的效果[8]。

試管苗生長在恒溫、高濕、弱光、無菌的環境條件下[19]，因此，出瓶移栽前必須經歷一個逐步馴化的過程。馴化時間的長短結合苗木的狀況，待試管苗莖稈明顯變硬后，再行移栽。馴化時間一般不能短于2周。移栽基質的種類對試管苗根系的生長影響較大，試管苗根系為不定根，根與莖的疏導組織連通性不好，移栽基質必須具有良好的疏松透氣性。純腐殖土基質透氣性不好，易造成爛根；純珍珠巖基質透氣性好，但水分流失快，一旦水分不足，苗木很容易萎蔫。因此，使用腐殖質土和珍珠巖按照一定比例配合使用較好。