海洋酸化與陸源DON對米氏凱倫藻和東海原甲藻生長的影響?

張艷紅， 賀云鳳， 李克強， 張現盛， 楊 銳， 逄 凱， 梁生康， 王修林

(中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

受全球CO2濃度升高影響，海水pH降低引起的海洋酸化愈來愈受到關注[1-2]。根據政府間氣候變化專門委員會(Intergovernmental Panel on Climate Change)的預測，到2100年pCO2將達到約800～1 000 ppmv，海洋表面pH值將降至7.8～7.7[3]。海洋酸化直接影響著海洋生態系統的結構與健康，甚至改變海洋生態系統[4-5]。研究表明，海洋酸化會對海洋生態系產生不利影響，如鈣化生物，深海珊瑚、淺水底棲無脊椎動物和海膽等可能是最為直接的受害者[5-8]。而且，海洋酸化與全球氣候變暖、紫外輻射增強和富營養化等的協同作用可能會對海洋浮游植物的生長產生潛在的影響[9]。

隨著社會經濟的高速發展，近岸海域的富營養化引起的有害藻華已成為世界性問題[10]。自1998年以來，幾乎每年的3-9月在東海長江口臨近海域爆發米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)以及東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)等有害赤潮[11](東海海洋公報)。近年來，米氏凱倫藻和東海原甲藻赤潮經常在中國福建沿海地區大規模爆發，引起魚類大量死亡，對海洋環境和漁業養殖造成巨大破壞[12-13]。研究表明，降雨導致的低鹽度和高營養鹽會使米氏凱倫藻細胞密度增加[14-15]，東海原甲藻和米氏凱倫藻具有垂直遷移的能力[16]，使它們能夠更有利獲得光能和營養鹽從而成為優勢藻種[17-18]。在河口和近海生態系統中，赤潮的種類，規模和持續時間與氮的含量和形態有密切關系[19]。高強度人類活動導致大量的含氮污染物排放入海，致使DON逐漸成為近岸海域氮的主要形態[20]。調查結果顯示，DON在海水中總溶解態氮(TDN)中有相當高的占比，如大亞灣，膠州灣，珠江口，東海淺陸架區，北黃海和廈門灣等近海區域，DON約為TDN的30%～90%[21-24]。研究表明，DON不僅可以做某些浮游植物的氮源，而且對浮游植物的競爭與演替也起著一定的作用[25]，DON含量的增加可能會誘發有毒有害赤潮發生[26]。例如，美國東海岸的兩個海灣爆發的抑食金球藻褐潮與DOM有關[27]；長江口及其領近海域爆發的東海原甲藻赤潮、米氏凱倫藻赤潮等赤藻的爆發可能是DOM在赤潮爆發過程中的供氮作用[28]；美國緬因州西部海灣的亞歷山大藻赤潮可能是由于高DON濃度引起的[29]。

DON是浮游植物生長的一種重要氮庫[30]，某些浮游植物能夠直接吸收利用DON[31]。例如，米氏凱倫藻和東海原甲藻可以直接吸收利用尿素[32-33]。但是由于DON的來源和結構組成復雜，人類活動產生的DON會對米氏凱倫藻和東海原甲藻的生長產生什么影響，相關的認識還十分有限，限制了對這兩種甲藻，特別是有毒米氏凱倫藻藻華的防治。因此，有必要研究人為源DON對兩種甲藻生長和競爭的影響。

活性氧(ROS)在浮游植物的毒理和生理途徑中起著關鍵的作用[34]。ROS通常以代謝副產物的形式出現[34]，在正常的生理活動中，ROS的產生與消除之間存在動態平衡[35]。在浮游植物中，過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化生物酶在消除ROS中起關鍵作用[36]。研究表明，當生物體受到外部脅迫時產生大量的ROS同時會提高SOD和CAT酶活性以清除體內產生的自由基來保護細胞免受氧化損傷[37]。酸化環境會導致浮游植物細胞內外的酸堿失衡，進而激活抗氧化系統[38]。利用藻類細胞酶活性的變化反映藻類中氧化應激的發生[39]，可以用來表征酸化等環境條件對浮游植物生長的影響。

東海原甲藻和米氏凱倫藻廣泛分布于中國沿海水域，在初春和夏季，長江口和東海沿岸經常爆發東海原甲藻和米氏凱倫藻赤潮，或者兩種藻演替發生。人為源DON和pCO2升高對東海和長江口附近的兩種甲藻赤潮發生的影響的了解還十分有限。為此，本文以人為來源的DON為氮源，通過一次性培養實驗，結合抗氧化生物酶活性，研究pCO2升高和DON加富對米氏凱倫藻和東海原甲藻的生長和競爭的影響，為控制和緩解赤潮提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本文于2018年4月初采集海泊河污水處理廠(36°6′0″N, 120°19′12″E)水樣作為城鎮生活源DON，水樣中DON和溶解無機氮(DIN)含量分別為2 124和515 μmol·L-1。隨后將所取水樣分別通過1 μm的混合膜和0.22 μm的醋酸纖維膜(用0.5 mol/L的鹽酸浸泡24 h并用Milli-Q水洗至中性)去除顆粒物和細菌。將收集到的濾液用1 000 Da膜(OmegaTM; PALL)的超濾系統(MinimateTM; Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)進行濃縮(濃縮比為1∶10)以減少DIN在TDN中的占比，得到的濃縮液中DON和DIN含量分別為4 341和347 μmol·L-1。培養實驗所用陳化海水取自膠州灣近海海域(36°5′42″N, 120°15′41″E)，在實驗室放置半年后海水中DON和DIN分別為9.7和1.5 μmol·L-1。

1.2 培養實驗

培養實驗所用米氏凱倫藻接種于中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室藻種室，東海原甲藻接種于中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室藻種室，藻種保存于f/2培養液并置于光照培養箱中(光照強度191 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h∶12 h，溫度為(20±1) ℃)。將培養實驗所用陳化海水用0.45 μm的醋酸纖維膜過濾除去顆粒物，再將過濾海水在121 ℃下高溫高壓滅菌20 min以除去海水中的細菌。將3.5 L滅菌海水加入到5 L錐形瓶中，然后用錫紙(實驗前450 ℃下灼燒4 h)密封(即不發生水交換)。通過連續鼓入(控制氣體體積流量約5 mL·min-1，蠕動泵最大轉速26.6 r·min-1)稱重配置空氣(99.999%的高純氣體，物質的量比CO2∶N2∶O2=1∶2 055∶500，pCO2為380 ppmv代表當前的pCO2水平)和稱重配置二氧化碳加富氣體(物質的量比CO2∶N2∶O2=1∶950∶250，pCO2為800 ppmv代表預測2100年的pCO2水平)[40]，分別對應于海水pH值8.10和7.81。在所有的碳酸鹽體系達到平衡后(pCO2: 380 ppmv對應的總堿度(TA)和無機碳(DIC)分別為1 980和2 087 μmol·L-1，pCO2: 800 ppmv對應的TA和DIC分別為2 145和2 193 μmol·L-1)加入藻種，分別將100 mL東海原甲藻和100 mL米氏凱倫藻分別加入相應培養體系，在混合培養體系分別加入50 mL東海原甲藻和50 mL米氏凱倫藻藻種(藻個數比為1∶1)。加入36 mL海泊河污水處理場濃縮樣作為實驗組，將與海泊河濃縮樣所含等量DIN(NO3-N和NH4-N；國藥集團化學試劑有限公司)添加的培養體系作為對照組。此外，本文添加了PO4-P(KH2PO4；國藥集團化學試劑有限公司)，維生素和微量元素(上海光語生物技術有限公司)(見表1)。東海原甲藻培養實驗周期為10天，取樣頻次為1天/次。米氏凱倫藻單獨培養實驗和兩種藻共培養實驗周期為20天，取樣頻次為2天/次。取樣前將培養體系搖勻，取混合藻液在顯微鏡下觀察兩種藻在混合培養體系中的生長情況，將200 mL藻液用0.7 μm的 GF/F玻璃纖維膜(Whatman公司，450 ℃下灼燒4 h)過濾，濾膜用于測定SOD酶、CAT酶活性和葉綠素，將濾液分別裝入60 mL的棕色玻璃瓶中并將樣品置于-20 ℃下保存，用于測定水體的DOC、TDN和DIN。

表1 米氏凱倫藻、東海原甲藻及兩種藻共培養的實驗條件

1.3 分析方法

TDN采用總碳/總氮自動分析儀(Multi N/C 3100; Analytik Jena AG, Jena, Germany)高溫催化氧化法測定[41]。DIN(NH4-N，NO3-N和NO2-N)使用營養鹽自動分析儀(AAⅢ; Bran+Luebe, Norderstedt, Germany)測定[42]。TDN和DIN差減得到DON(DON=TDN-DIN)。使用庫侖法[43]和自動電位滴定法[44]分別測得DIC和 TA。用間甲酚紫指示的分光光度法測定海水的pH[45]。將濾膜用90%丙酮萃取后，使用紫外分光光度法測定Chla濃度[46]。

SOD活性以每微克樣品的酶單位表示(U·μg-1)，依據SOD在光下對抑制氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)的還原作用來確定SOD的酶活性[47]。依據CAT可在磷酸緩沖液中催化H2O2，可用H2O2的減少速率來確定CAT的酶活性[48]。

1.4 數據處理方法

浮游植物的生長過程符合Slogistic2生長模型，通過Origin8.5軟件(The Microcal Inc.)對生長曲線進行擬合[49]：

其中：Bt為t時刻的生物量(Chla，μg·L-1)；Bf為終止生物量(Chla，μg·L-1)；B0為初始生物量(Chla，μg·L-1)；μmax為最大生長速率(μg·L-1·h-1)。

氮吸收過程采用Monod方程[50]，并將其修改為：

實驗結果的顯著性采用T檢驗方法，應用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc)進行分析，顯著性水平設置為α=0.05。

2 實驗結果與數據處理

2.1 浮游植物生長

對于單種藻培養體系，東海原甲藻在兩種pCO2條件下均較米氏凱倫藻提前5天進入指數生長期(見圖1)。在pCO2為380 ppmv的正常條件下，東海原甲藻和米氏凱倫藻的平臺期分別持續了約1和4天(見圖1(a)和1(b))，而pCO2的升高(800 ppmv)使得東海原甲藻比正常情況下提前1天進入死亡期，同時終止生物量也降低了約40%(見圖1(a)和1(d)，表2)，而米氏凱倫藻則在不同pCO2條件下同步生長和死亡，只是終止生物量低約20%(見圖1(b)和1(e)，表2)。對于兩種藻混合培養體系，進入指數生長期的時間與東海原甲藻一致，而平臺期持續時間，在正常條件下約8天，pCO2升高酸化條件下則只有4天，并提前6天到達死亡期，終止生物量降低了約40%(見圖1(c)和1(f)，表2)。藻分類結果顯示，兩種藻混合培養下，培養實驗的第2天以東海原甲藻占絕對優勢，此后米氏凱倫藻逐漸增加，進入第6天后占據對優勢。在整個培養實驗期間，pH的波動范圍為0.1±0.04(見圖1)。

(陰影為pH值，實線是實驗測定Chl a濃度，虛線為DON加富培養體系的Chl a濃度減對照培養體系的Chl a濃度，表示單獨DON為氮源下浮游植物的生長曲線。Shadow is pH value, the solid lines are Chl a measured by experiment and the dotted line is the growth curve of phytoplankton using dissolved organic nitrogen (DON) as the nitrogen source by subtracting the Chl a of the DIN control treatment from DON enrichment treatment.)

表2 東海原甲藻、米氏凱倫藻和混合藻以DON為氮源在不同pCO2條件下(380和800 ppmv)的生長和氮吸收動力學參數

浮游植物生長動力學擬合結果顯示，東海原甲藻的最大生長速率比米氏凱倫藻略快(見表2)。在正常pCO2條件下，二種藻單獨培養均顯著小于(P<0.05)混合培養下的表觀最大生長速率(見表2)；而在pCO2升高酸化條件下，三者的最大生長速率沒有顯著差異(P>0.05)。

2.2 營養鹽吸收

東海原甲藻單獨培養下，其兩種pCO2條件下DON的消耗均快于米氏凱倫藻培養下的(見圖2)。這與其吸收動力學擬合結果一致，即東海原甲藻對DON及其降解產物DIN的最大氮吸收速率，在兩種pCO2條件下均顯著高于(P<0.05)米氏凱倫藻的，同時也顯示東海原甲藻對DON吸收的半飽和常數顯著低于(P<0.05)米氏凱倫藻的(見表2)。而二種藻混合培養時，DON的消耗與東海原甲藻單獨培養接近，較米氏凱倫藻單獨培養快(見圖2)。這也反映在其吸收動力學上，即兩種藻共培養時，其DON的表觀最大氮吸收速率和半飽和常數均與東海原甲藻的接近，不存在顯著差異(P>0.05)，均顯著高于(P<0.05)米氏凱倫藻的(見表2)。pCO2升高對東海原甲藻和米氏凱倫藻對DON的最大吸收速率和半飽和常數沒有顯著影響(P>0.05)，但會顯著增大(P<0.05)對DON吸收的最小濃度閾值(見表2)。

圖2 實驗組和對照組在不同pCO2(380和800 ppmv)條件下東海原甲藻(a、d、g)、米氏凱倫藻(b、e、h)和混合藻培養物(c、f、i)中各形態氮濃度變化Fig.2 The nitrogen concentration fluctuations in the Prorocentrum donghaiense (a, d, g), Karenia mikimotoi (b, e, h), and mixed algal cultures (c, f, i) of DON enrichment treatments and DIN control groups under different pCO2 conditions (380 and 800 ppmv)

親和力指數(Vmax/Ks)可以用來評估浮游植物對營養底物的親和力，較高的親和力指數表示浮游植物具有較高的競爭力[52]。實驗結果顯示，在DON為氮源單藻培養下，米氏凱倫藻的Vmax/Ks在兩個pCO2條件下均顯著低于東海原甲藻的Vmax/Ks(P<0.05)，這表明米氏凱倫藻的競爭力低于東海原甲藻。在兩個pCO2條件下，混合藻培養的表觀Vmax/Ks值與東海原甲藻Vmax/Ks更加接近，不存在顯著性差異(P>0.05)，可能與兩者共培養下東海原甲藻優先成為優勢種有關。

2.3 SOD和CAT酶活性

在pCO2為380 ppmv正常條件下，東海原甲藻培養體系的SOD酶活性隨時間先增加后降低，并在第2天達到酶活性最大值(見圖3(a))；在整個培養實驗期間米氏凱倫藻培養體系的SOD酶活性相對恒定(見圖3(b))；兩種藻共培養的SOD酶活性和米氏凱倫藻單獨培養具有相同的趨勢(見圖3(c))。在pCO2為800 ppmv酸化條件下，所有實驗組中的SOD酶活性均隨時間先增加后降低(見圖3)。采用浮游植物指數生長期的平均SOD酶活性來表示其對環境壓力的響應(見表3)。結果表明，以DIN實驗組為對照，在正常培養條件下，DON的加入對東海原甲藻、米氏凱倫藻和兩種藻混合培養下的SOD酶活性沒有顯著影響(P>0.05)(見表3)；酸化增加了米氏凱倫藻的SOD酶活性，而對東海原甲藻的SOD酶活性增加影響不大(見圖3)。

圖3 在不同pCO2(380和800 ppmv)條件下實驗組和對照組的東海原甲藻(a、d)、米氏凱倫藻(b、e)和混合藻(c、f)體系中的超氧化物歧化酶(SOD)Fig.3 Superoxide dismutase (SOD) in the Prorocentrum donghaiense (a, d), Karenia mikimotoi (b, e), and mixed algal cultures (c, f) of the DON enrichment treatments and the DIN control treatments under different pCO2 conditions (380 and 800 ppmv)

表3 在不同pCO2(380和800 ppmv)條件下實驗組和對照組的東海原甲藻、米氏凱倫藻和混合藻體系中的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)酶活性Table 3 Catalase (CAT) and Superoxide dismutase (SOD) enzyme activities in the Prorocentrum donghaiense, Karenia mikimotoi, and mixed algal cultures of the DON enrichment treatments and DIN control treatments under different pCO2 conditions (380 and 800 ppmv)

東海原甲藻和米氏凱倫藻單獨培養體系的CAT酶活性，在兩個pCO2條件下變化趨勢基本一致，其中，東海原甲藻培養體系的CAT酶活性隨時間降低(見圖4(a))，而米氏凱倫藻培養體系的CAT酶活性則先升高后降低，并在第2天達到酶活性最大值(見圖4(b))。對混合培養體系的CAT酶活性變化趨勢分析發現，酸化條件下和米氏凱倫藻單獨培養的變化趨勢一致，而在正常條件下和東海原甲藻單獨培養的變化趨勢一致(見圖4(c))。分析指數生長期平均CAT酶活性表明(見表3)，相對于DIN對照培養體系，DON的加入對兩種藻單獨培養和混合培養的CAT酶活性均影響不大，而酸化顯著增加(P<0.05)了東海原甲藻和混合藻培養體系的CAT酶活性(見表3)。

圖4 在不同pCO2(380和800 ppmv)條件下實驗組和對照組的東海原甲藻(a、d)、米氏凱倫藻(b、e)和混合藻(c、f)體系中的過氧化氫酶(CAT)Fig.4 Catalase (CAT) in the Prorocentrum donghaiense (a, d), Karenia mikimotoi (b, e), and mixed algal cultures (c, f) of the DON enrichment treatments and DIN control treatments under different pCO2 conditions (380 and 800 ppmv)

3 討論

海洋酸化(pCO2升高)會影響浮游植物的生長和營養鹽吸收，本文實驗結果顯示，米氏凱倫藻和東海原甲藻的生長均明顯受到酸化的抑制，而對DON的吸收則影響不大。在pCO2為380 ppmv的正常培養條件下，東海原甲藻較米氏凱倫生長略快，對氮營養鹽的吸收則顯著快于米氏凱倫藻。而在海洋酸化(pCO2升高)條件下，米氏凱倫藻較東海原甲藻生長速率受抑制更為顯著，而終止生物量與東海原甲藻下降幅度相當。有研究表明，pCO2升高致使細胞的能量流通減少，細胞對氮營養鹽的吸收降低，進而導致蛋白質的合成效率降低[53]，但這與我們實驗中氮吸收速率不變而生長變慢，特別是終止生物量顯著下降不同。pCO2升高能破壞浮游植物的細胞結構并導致其生理調節機制變化，如營養鹽代謝、細胞膜氧化還原和電子轉移等[54]。此外，細胞外的pH變化還可能導致細胞內外酸堿失衡，引起細胞酸中毒[55]。這些酸化條件下能量的消耗，可能是本實驗中米氏凱倫藻和東海原甲藻營養鹽吸收能力受酸化影響較小，而生長受到明顯抑制的原因。

海洋酸化對東海原甲藻和米氏凱倫藻生長的抑制作用還體現在抗氧化酶系統上，表現為SOD和CAT等抗氧化酶活性的變化?？寡趸冈谒峄瘲l件下維持細胞內氧化還原平衡中起著重要作用，pCO2水平的升高，導致米氏凱倫藻、東海原甲藻和混合藻培養體系中的CAT或SOD等抗氧化酶活性較正常pCO2水平條件下增加，這與以前的研究結果一致[56]。研究表明，當杜氏藻暴露于鹽度脅迫下時，細胞內SOD活性隨鹽度水平的升高而增加[57]；在強光下培養威氏海鏈藻的ROS產量增加伴隨著SOD和CAT酶活性增加[58]。酶活性的變化可能是浮游植物受生長環境脅迫時，引起自身生理特性的適應性調節[59]。盡管大多數氧化損傷可以通過自然防御機制克服，但持續的損傷也可能導致細胞死亡[54]。在我們的研究中，浮游植物的終止生物量都隨著pCO2水平升高而降低(P<0.05)。

研究表明，富營養化和海洋酸化可以改變赤潮期間浮游植物的優勢種群，并對生態系統功能產生潛在的影響[65]。本文實驗結果顯示，當以DON作為氮源時，在正常培養條件下，東海原甲藻較快的進入指數生長期并在初期成為優勢種，而米氏凱倫藻能夠繼續利用DON，在后期成為優勢種(見圖5(a))。在中國福建省沿海地區也常發生東海原甲藻赤潮和米氏凱倫藻赤潮同時或交替發生現象[60]，赤潮爆發期間藻優勢種變化是一種正常的生態現象并且可能受營養鹽的影響[61-62]。在我們的研究中，混合藻的最大生長速率比單一藻培養的最大生長速率快(見圖5(a)和(c)，表2)，可能是東海原甲藻與米氏凱倫藻在共培養體系中，協同性生長，先后或錯位吸收環境中的DON[63]?；旌显迮囵B體系的SOD和CAT酶活性值沒有明顯增加，其中，SOD酶活性和米氏凱倫藻單獨培養下有相同的變化趨勢，CAT酶活性和東海原甲藻單獨培養下有相同的變化趨勢，這進一步表明在共培養體系中兩種藻可能具有協同作用。pCO2的升高使得東海原甲藻和米氏凱倫藻混合培養的生長速率顯著下降，并且酸化條件下的平臺期比正常條件下平臺期維持的時間要短(見圖5(b)，表2)，表明海洋酸化可能會造成兩種甲藻的生態位發生變化，引起米氏凱倫藻提前與東海原甲藻進行競爭，造成營養鹽的早期消耗而限制了實驗后期米氏凱倫藻的生長(見圖5(d))。這也體現在酸化條件下混合藻培養體系的SOD酶和CAT酶活性的顯著增加，并且與米氏凱倫藻的SOD酶和CAT酶活性的增加趨勢更加接近，表明了pCO2水平升高對共培養體系中米氏凱倫藻生長可能有更大的刺激和抑制作用。

海洋酸化和富營養化對海洋環境產生嚴重影響，并可能在未來不可逆轉地改變海洋生態系統[9,64-65]。藻類優勢種的變化是一個相對復雜的過程，受眾多環境因素的影響[66]。需要針對海洋酸化和富營養化(例如人為源DON排放增加)對海洋浮游植物的影響開展長期的研究。

(虛線和實線分別為東海原甲藻和米氏凱倫藻單獨培養和二者混合培養的生長曲線和營養鹽吸收曲線。左起第一根黑色虛線表示米氏凱倫藻開始生長和開始快速吸收利用DON的時間，左起第二根黑色虛線表示東海原甲藻進入死亡期時間和快速吸收DON終止時間。The dotted line and the solid line are the growth curve and nutrient absorption curve of Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi cultured separately and the Prorocentrum donghaiense and Karenia mikimotoi co-culture, respectively. The first black dotted lines from the left indicate the time of Karenia mikimotoi began to grow and to rapidly absorb and utilize DON, the second black dotted lines from the left indicate the time of Prorocentrum donghaiense entered the death period and the end time of the DON was absorbed rapidly by Prorocentrum donghaiense.)

4 結論

本文研究pCO2的升高和人為源DON對米氏凱倫藻和東海原甲藻生長和競爭的影響。采用一次性營養鹽加富培養實驗，結論如下：

(1)海洋酸化即pCO2升高會抑制東海原甲藻和米氏凱倫藻的生長，但不抑制其對DON的吸收，生長的抑制作用體現在抗氧化酶活性(SOD和CAT)隨pCO2水平升高而增加。

(2)在人為源DON加富培養條件下，東海原甲藻比米氏凱倫藻更具有競爭力，優先成為優勢種，而米氏凱倫藻可以繼續利用DON提供的氮庫，并在滯后階段后成為優勢種；升高的pCO2，使得這兩種甲藻在競爭條件下生長均受到抑制，特別是米氏凱倫藻受到的影響更大，改變了這兩種甲藻的協同交替生長模式。