發酵大豆蛋白肽粉營養價值及功效性研究

杜玉蘭，嚴建剛，李曉敏，喻勤，李翠華，毛新亮

1(完美(廣東)日用品有限公司，廣東 中山,528451)2(廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山,528451)

大豆蛋白食品具有保健、預防相關疾病的功效，諸如調節人體血脂，降低膽固醇、脂肪肝，減少患心血管病的危險，預防膽結石的形成；調節人體鈣質的代謝，從而降低患骨質疏松癥的危險，預防腎結石的形成；調節性激素效應，從而減輕婦女更年期綜合征癥狀等[1-2]。但大豆分離蛋白分子質量較大，分子結構也較為復雜，食用后消化吸收慢，且含有多種抗營養因子[3]、致敏成分[4]等，影響其營養價值及應用。作為一種先進的蛋白質加工技術，“酶膜耦合”定向酶解，聯合復合菌種發酵技術可解決上述問題。該技術，可破壞原料蛋白過敏原的構象表位和線性表位，降低過敏性風險，去除抗營養因子，改善消化吸收特性。但針對此技術生產的發酵大豆蛋白肽粉營養價值及功效性未見報告，故本研究開展發酵大豆蛋白肽粉的營養價值及功效性研究，以期為以后的應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大豆分離蛋白，禹王；乳清蛋白(蛋白質含量≥80%)，丹麥Arla；發酵大豆蛋白肽粉：以大豆分離蛋白為原料，先通過蛋白酶進行部分酶解，然后使用類干酪乳桿菌、戊糖片球菌復合菌種發酵制得；野生型AB品系斑馬魚：實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2012—0171，飼養管理符合國際AAALAC認證(認證編號：001458)的要求。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶和胰酶，Sigma；4%組織細胞固定液，Solarbio；二甲苯，上海麥克林生化科技有限公司；PBS緩沖液，武漢博士德生物工程有限公司；Mayer蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹脂封片劑，上海依赫生物科技有限公司；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CX31生物顯微鏡、SZX7解剖顯微鏡，日本OLYMPUS；VertAl CCD相機，上海土森視覺科技有限公司；CP214精密電子天平，美國OHAUS；6孔板、12孔板、96孔板，中國Nest Biotech；SPARK多功能酶標儀，瑞士TECAN。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外消化模擬試驗

胃消化、腸道消化模擬實驗方法參考文獻[5]。

1.3.2 致敏性評價試驗

檢測方法及原理參考文獻[6-7]，詳細操作如下：隨機選取300尾4 dpf野生型AB品系斑馬魚于12孔板中，每孔(實驗組)均處理10尾斑馬魚。根據前期濃度摸索結果，發酵大豆蛋白肽粉對正常斑馬魚的無可見有害作用水平(no observed adverse effect level,NOAEL)為500 μg/mL，以NOAEL劑量1/9、1/3和1設定低劑量組、中劑量組和高劑量組，即發酵大豆蛋白肽粉質量濃度為55.6、167、500 μg/mL，同時設置正常對照組。每孔容量為1 mL，每個實驗組設置6個平行。各實驗組與N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯酰胺鹽酸鹽(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline HCl, BAPNA)共同處理24 h后，將液體轉移至96孔板中，250 μL/孔，利用酶標儀檢測各實驗組類胰蛋白酶的相對吸光度值，以吸光度值(平均值±標準差)評價發酵大豆蛋白肽粉誘發類過敏的情況。

1.3.3 肌肉保護試驗

檢測方法參考COFFEY等[8]研究,詳細操作如下：隨機選取120尾2 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。除正常對照組外，其余各實驗組均給予1.5%無水乙醇、24 h，建立斑馬魚酒精性肌損傷模型。分別給予以下樣品：發酵大豆蛋白肽粉和乳清蛋白質量濃度均為102.30 μg/mL，同時設置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理24 h后，用4%組織細胞固定液固定，對斑馬魚進行蘇木精-伊紅染色(固定-脫水-包埋-切片-染色)，并進行病理學分析評價樣品肌肉保護功效。評分標準見表1。

表1 斑馬魚肌肉保護功效評價標準Table 1 Evaluation criteria for muscle protection of zebrafish

2 結果與分析

2.1 營養成分分析

由表2、表3可以看出，大豆分離蛋白粉通過部分酶解，蛋白質的含量略有降低，但氨基酸構成比例幾乎沒有變化，但發酵大豆蛋白肽粉形成整蛋白、多肽、低聚肽、氨基酸等多重氮源，可以實現梯度吸收，降低代謝負擔。通過發酵，碳水化合物含量略有增加，主要是因為通過發酵產生一定量有機酸等后生元成分。有機酸能夠提高胃酸分泌量，促進營養物質的消化吸收。同時有機酸可以降低腸道內pH值，具有重要的腸道調節功能。

表2 發酵大豆蛋白肽粉與大豆分離蛋白粉營養成分對比分析Table 2 Nutritional components of fermented soybean protein peptide powder and soybean protein isolate powder

2.2 體外消化模擬試驗

大豆分離蛋白粉通過部分酶解及復合菌種發酵之后胃消化率由原來的68.57%提高到81.61%，腸消化率由原來的76.35%提高到87.49%。發酵大豆蛋白肽粉可能是通過部分酶解形成蛋白質和肽混合，通過發酵產生一些有機酸等代謝產物，這些成分在水溶液中會通過分子間相互作用力，比如氫鍵、范德華力等相互結合，使得蛋白酶與蛋白質的結合位點被暴露，從而促進蛋白的消化。

表3 發酵大豆蛋白肽粉與大豆分離蛋白粉氨基酸組成對比分析 單位：%

2.3 致敏性評價試驗

類胰蛋白酶是肥大細胞內預先合成的中性蛋白酶，是臨床上檢驗人體是否過敏的重要指標[9-10]。受肥大細胞活化劑BAPNA作用后，斑馬魚會產生過敏反應，誘導肥大細胞分泌類胰蛋白酶。類胰蛋白酶的OD值與類過敏反應程度成正相關。斑馬魚致敏性試驗結果見表4。

由表4可知，發酵大豆蛋白肽粉55.6、167、500 μg/mL質量濃度組OD值分別為0.116、0.085、0.094，與正常對照組相比具有極其顯著性差異，分別降低了43%、58%、53%，說明發酵大豆蛋白肽粉在一定濃度范圍內不會誘發類過敏反應，降低致敏性風險同時可能存在抗敏性。

2.4 肌肉保護試驗

由圖1可知正常對照組斑馬魚肌肉細胞呈均一長條狀，且橫紋清晰，模型對照組肌纖維松弛，但未見浸潤和壞死，乳清蛋白及發酵大豆蛋白肽粉處理組肌纖維紋理清晰、結構緊密，與正常對照組較為相似，具有明顯的肌肉保護功效。

a-正常對照組；b-模型對照組； c-乳清蛋白組102.3 μg/mL；d-發酵大豆蛋白肽組102.3 μg/mL圖1 斑馬魚肌肉保護試驗病理切片圖Fig.1 Pathological section of zebrafish muscle protection test

由表5可知，模型對照組相比于正常對照組具有極其顯著性差異，說明造模成功。乳清蛋白組及發酵大豆蛋白肽組相對模型對照組具有極顯著性差異，說明乳清蛋白和發酵大豆蛋白對斑馬魚都具有肌肉保護作用。乳清蛋白組相對發酵大豆蛋白肽粉組沒有顯著性差異，說明發酵大豆蛋白肽粉對肌肉保護作用效果等同于乳清蛋白。

表5 肌肉保護試驗結果匯總表Table 5 Summary of muscle protection test results

3 結論

發酵大豆蛋白肽粉以大豆分離蛋白為原料，通過現代生物“酶膜耦合”定向酶解和復合菌種發酵技術精制而成，富含整蛋白、多肽、低聚肽、有機酸等活性成分。體外消化試驗顯示發酵大豆蛋白肽粉相對大豆分離蛋白在胃、腸道消化率均有提高，李世成等[11]研究發現相對補充大豆分離蛋白，補充大豆低聚肽具有更高的表觀消化率、儲存率和凈氮利用率，與本文結論相似。致敏性評價結果顯示發酵大豆蛋白肽粉致敏性降低，在一定濃度下不會誘發致敏性反應，具有抗過敏性作用，可能機理為大豆分離蛋白通過酶解和發酵破壞了原料蛋白過敏原的構象表位和線性表位，弱化過敏信號通路，有效降低了致敏風險，與前人研究結果一致[12-13]。乳清蛋白富含支鏈氨基酸尤其是亮氨酸，且乳清蛋白屬于快膳食蛋白[14]，是被認為抵抗肌肉衰減最有效的蛋白質之一，對肌肉具有較強保護作用[15]，多個研究表明乳清蛋白在增肌，促進肌肉合成方面優于大豆蛋白[16-19]。但長期補充乳清蛋白質可能會對腸道微生物群產生負面影響[20]。本實驗肌肉保護實驗顯示發酵大豆蛋白肽粉具有肌肉保護作用，同時具有低致敏性，其在預防老年肌肉衰減產品及運動增肌產品應用前景廣闊。