基于網絡藥理學及分子對接探討杜仲葉防治骨質疏松的作用機制

趙繼榮 楊濤 陳祁青 馬同 趙寧 薛旭 郭培堯 李瑋農 張立存

摘要 目的：采用網絡藥理學-分子對接預測杜仲葉防治骨質疏松癥的作用機制。方法：利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）及SwissTargetPrediction分析平臺對杜仲葉活性成分及作用靶點進行篩選，使用GeneCards、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫、治療靶點數據庫（TTD）對骨質疏松癥的對應靶標進行篩選，將中藥靶基因與疾病靶基因相交集，將交集靶點導入Cytoscape軟件構建成分靶點網絡，使用STRING分析平臺及Cytoscape軟件構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，篩選核心靶點。對中藥-疾病共同靶標進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）功能富集分析，得出中藥-疾病共同靶標相關的信號通路，最后運用AutoDock與Pymol軟件對預測靶標與其對應的成分進行分子對接。結果：篩選后得到杜仲葉治療防治骨質疏松癥的有效成分7個，杜仲葉-骨質疏松癥共同靶標231個，并推斷其作用機制可能與動脈粥樣硬化信號通路的下游核因子κB信號通路，MAPK信號通路、TNF、PI3K-AKT、IL-17及HIF-1信號通路等有關，且MAPK1、STAT3、VEGFA、IL6、TP53、EGF、AKT1、JUN、MAPK8、EGFR、TNF基因可能起著關鍵的作用。結論：杜仲葉可能通過減輕氧化應激損傷、抑制破骨細胞形成、促進成骨細胞形成等作用發揮抗骨質疏松作用。

關鍵詞 網絡藥理學;分子對接;杜仲葉;骨質疏松癥;分子機制;信號通路

Mechanism of Eucommia ulmoides Oliv.Leaves in Preventing and Treating Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jirong1，YANG Tao2，CHEN Qiqing1，MA Tong1，ZHAO Ning1，XUE Xu1，GUO Peiyao1，LI Weinong2，ZHANG Licun2

（ Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China; 2 Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730030，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Eucommia ulmoides Oliv.Leaves in treating osteoporosis based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and targets of E.ulmoides leaves were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and SwissTargetPrediction，and the corresponding targets of osteoporosis were searched by GeneCards，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM） and Therapeutic Target Database（TTD）.The targets of Chinese herbal medicine and disease were intersected and input into Cytoscape to construct the component-target regulatory network.The protein-protein interaction（PPI） network was constructed by STRING and Cytoscape to screen the core targets.Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） functional enrichment analysis were carried out on the common targets of Chinese herbal medicine and disease，and the signaling pathways related to the common targets were obtained.Finally，AutoDock and Pymol were used for molecular docking between the predicted targets and its corresponding components.Results：After screening，7 active components of E.ulmoides leaves in the treatment of osteoporosis were obtained，and 23 common targets were identified.The mechanism was inferred to be related to NF-κB，MAPK，TNF，PI3K-Akt，IL-17，and HIF- signaling pathways，and MAPK1，STAT3，VEGFA，IL6，TP53，EGF，AKT1，JUN，MAPK8，EGFR and TNF genes might play a key role.Conclusion：E.ulmoides leaves may exert the anti-osteoporosis effect by alleviating oxidative stress injury，inhibiting osteoclast formation and promoting osteoblast formation.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Eucommia ulmoides leaves; Osteoporosis; Molecular mechanism; Signaling pathway

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.012

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種因骨密度降低和骨組織微結構破壞導致的骨骼強度減低而易發生骨折的慢性骨代謝性疾病[1]。人口老齡化及糖皮質激素的廣泛使用使OP已成為“隱形的殺手”[2]。據統計，全球約2億人患有OP，由其引發的骨折每年高達890萬次以上，而在中國，50歲以上的近700萬人患有OP，并且每年會造成68.7萬例髖部骨折[3]。中醫將OP稱為“骨萎、骨枯、骨極”，根據中醫經典理論“腎主骨生髓”，近年來在探索挖掘中醫藥防治OP方面成果顯著。研究發現補腎中藥牛膝[4]、淫羊藿[5]、杜仲[6]等對OP均具有較好的防治效果。而杜仲為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，資源稀缺，是我國特有的第三紀孑遺植物，是國家二級珍貴保護樹種[7]，主要藥用部位為其干燥樹皮，但只有15年以上杜仲樹才可剝皮藥用，且剝皮后的杜仲樹要經過3～4年的生長修復才可再次剝皮，并且常因剝皮后護養不當造成皮剝樹死[8-9]。由于杜仲為單科、單屬、單種類植物，新藥源的開辟只能從其自身非藥用部位入手，故杜仲葉能否作為杜仲皮的替代品是目前杜仲新藥源的研究熱點。杜仲葉（Eucommia Folium）為杜仲科植物杜仲的干燥葉，具有補肝腎、強筋骨之效。用于肝腎不足，頭暈目眩，腰膝酸痛，筋骨痿軟[10]。研究發現杜仲葉與杜仲皮有效成分及藥理作用大致相同。目前從杜仲葉中分離鑒定出有機化合物約70種以上，無機礦物元素15種以上。大致可分為環烯醚萜類、木脂素類、黃酮類、酚類等[11]。其有效成分能夠抗肝纖維化，保肝利膽，抑菌抗氧化，并且能夠改善骨質疏松的骨微結構，增加骨密度，發揮抗骨質疏松的作用[12]。

本研究采用網絡藥理學及分子對接技術探索杜仲葉防治OP的作用機制，為進一步研究杜仲葉能否替代杜仲用于防治OP提供科學的理論依據。

資料與方法

1. 資料來源

本研究所使用的研究平臺及各大數據庫見表1。

1.2 方法

1.2. 篩選杜仲葉主要化學成分

在 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索杜仲葉化學成分，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為標準，初步篩選候選化合物，然后進一步查閱文獻對化合物進行進一步補充[13]。

1.2.2 收集藥物作用靶點

檢索TCMSP，篩選出1.2.1中化合物作用靶點，使用UniProt數據庫將靶點基因名稱規范為官網名稱。利用SwissTargetPrediction平臺，再次對候選化合物的靶點基因進行預測，然后將篩選出的2個數據庫潛在作用靶點合并，刪除重復值，得到藥物潛在的作用靶點基因。

1.2.3 已知OP疾病靶點基因的獲取

在GeneCards、OMIM、TTD數據庫中以“osteoporosis”為檢索詞對已知的OP靶點基因進行檢索和篩選，刪除重復基因后得到疾病靶點基因。

1.2.4 篩選藥物靶點基因和疾病靶點基因的交集

運用Venny平臺將1.2.2中所得靶點與1.2.3所得靶點進行交集，所得交集靶點即為杜仲葉治療OP的可能作用靶點。

1.2.5 構建中藥-成分-疾病-靶點網絡圖

應用Cytoscape 3.7.2軟件構建中藥、成分、疾病及靶點互作網絡。節點（node）表示中藥、成分、疾病、靶點。邊（edge）表示中藥-成分-疾病-靶點之間的相互聯系。

1.2.6 Hub網絡的提取及Hub中的靶標

利用STRING在線軟件構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡圖，將導出string interactions的文件導入Cytoscape 3.7.2軟件，對網絡進行拓撲分析，計算得Degree、BC、CC的中位數，根據大于2倍Degree中位數和大于其他指標中位數的篩選標準，選出關鍵節點。

1.2.7 基因功能和富集分析

使用Metascape平臺對作用靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）注釋分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，然后使用GraphPad Prism 7.0將分析結果可視化。

1.2.8 有效成分與核心靶點的分子對接

根據Degree值高低對靶點基因進行排序，在PDB數據庫下載相應靶點蛋白結構的3D結構，保存為pdb格式文件，在Pubchem數據庫獲取有效成分的sdf格式文件，使用Pymol軟件將蛋白質分子去水，去磷酸根，使用AutoDockTools進行對接。

2 結果

2. 杜仲葉主要活性成分的篩選

杜仲葉主要活性成分的篩選 在TCMSP數據庫中檢索得到杜仲葉有效成分78個，根據OB≥30%，DL≥0.18，得有效成分3個，檢索相關文獻后發現杜仲葉中的苯丙素類化合物綠原酸含量豐富，一般可達1%～5%，為杜仲葉主要成分;而綠原酸能夠通過Shp2/Erk信號通路促進大鼠成骨細胞的增值;另外，京尼平苷酸及桃葉珊瑚苷可促進膠原的合成，而Ⅰ型膠原是骨基質中的主要膠原;金絲桃苷可以促進骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨分化。因此，經過TCMSP數據庫篩選及文獻補充，共得到杜仲葉治療OP的主要活性成分7個。見表2。

2.2 杜仲葉作用靶點預測

經過檢索TCMSP數據庫，使用Uniprot數據庫轉化基因名后得到潛在靶點249個，SwissTargetPrediction數據庫獲得基因靶點500個，將2個數據庫基因靶點合并去重后得到杜仲葉治療OP的潛在靶點基因396個。通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數據庫，刪除重復值后得到與OP相關的靶點基因4 138個。使用Venny 2.1.1在線平臺將藥物作靶點基因與疾病靶點基因進行交集，得到二者的韋恩圖及藥物疾病的共有靶點基因231個。見圖1。

2.3 成分靶點網絡的構建

以231個靶基因作為杜仲葉治療OP的潛在靶點構建杜仲葉治療OP的成分靶點圖。見圖2。圖中共有238個節點，430條邊，節點代表藥物成分及作用靶基因，邊代表成分與靶基因的相互作用。此圖充分體現了杜仲葉多成分、多靶點治療OP的機制。

2.4 靶基因PPI網絡圖構建及關鍵靶基因的篩選

Venny分析得到231個交集靶點導入STRING數據庫，去除16個無相互作用的靶點，將導出String Interactions的文件導入Cytoscape 3.7.2軟件，對網絡進行拓撲分析，計算得Degree、BC、CC的中位數分別為13、0.005 9、0.666 7，根據大于2倍Degree中位數和大于其他指標中位數的篩選標準，選出24個關鍵節點。見圖3。所得關節靶點基因及其Degree、BC、CC值見表3。

2.5 GO注釋分析與KEGG富集分析

將杜仲葉治療OP的231個潛在靶點輸入Metascape數據庫，對其進行GO注釋分析和KEGG信號通路分析，將輸出的結果使用GraphPad Prism 7.0進行可視化。杜仲葉治療OP潛在靶點的GO注釋分析見圖4，KEGG信號通路可視化見圖5。

GO分析結果顯示：在分子功能（Molecular Function，MF）（圖4A）與激酶結合（Kinase Binding）、蛋白激酶結合（Protein Kinase Binding）、蛋白質結構域特異性結合（Protein Domain Specific Binding）、蛋白激酶活性（Protein Kinase Activity）、內肽酶活性（Endopeptidase Activity）、轉錄因子結合（Transcription Factor Binding）、核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、轉錄因子活性（Transcription Factor Activity）、磷酸轉移酶活性（Phosphotransferase Activity）、激酶活性（Kinase Activity）、蛋白質同源二聚體活性（Protein Homodimerization Activity）等分子功能有關;在生物過程（Biological Process，BP）（圖4B）涉及細胞對傷害的反應（Response to Wounding）、細胞對有機氮化合物的反應（Cellular Response to Organonitrogen Compound）、細胞對氮化合物的反應（Cellular Response to Nitrogen Compound）、對脂多糖的反應（Response to Lipopolysaccharide）、細胞因子介導的信號通路（Cytokine-mediated Signaling Pathway）、對細菌來源分子的反應（Response to Molecule of Bacterial Origin）、調節細胞正向遷移（Positive Regulation of Cell Migration）、傷口愈合（Wound Healing）、細胞運動的正向調節（Positive Regulation of Cell Motility）、細胞成分運動的正調節（Positive Regulation of Cellular Component Movement）、對有毒物質的反應（Response to Toxic Substance）等生物過程;而細胞組分（Celluar Component，CC）（圖4C）涉及膜筏（Membrane Raft）、膜微區（Membrane Microdomain）、膜區（Membrane Region）、囊腔（Vesicle Lumen）、細胞質囊腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）、細胞外基質（Extracellular Matrix）、胞質核周區（Perinuclear Region of Cytoplasm）、溶泡（Lytic Vacuole）、溶酶體（Lysosome）等組分。

KEGG通路分析顯示杜仲葉治療OP的靶點主要涉及腫瘤（前列腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌）信號途徑、PI3K-AKT信號通路、乙肝信號通路、人類嗜T淋巴細胞病毒Ⅰ型感染、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、動脈粥樣硬化信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、內分泌抵抗信號通路、IL-17信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、細胞凋亡、MAPK、HIF-1及FoxO信號通路等多種信號通路。見圖5。

2.6 分子對接

對杜仲葉中篩選得到的7個核心成分與Degree值大于35的11個核心靶點進行分子對接，以得到的結合能值作圖，其中京尼平苷酸與桃葉珊瑚苷與核心靶點對接失敗，其余對接結果見圖6。圖中橫坐標代表靶蛋白，縱軸為杜仲葉活性成分，圖中顏色越綠代表結合能越低，顏色越紅代表結合能越高，最低結合能≤-5.0 kJ/mol即表明藥效分子與靶蛋白對接效果良好，結合能越低，表明分子與靶蛋白結合能力越佳。結果表明山柰酚與活性位點附近的3個Tyr-119及Pro-117、Lys-98這5個氨基酸形成氫鍵結合到TNF，結合能為-8.48 kJ/mol，與活性位點附近的Ser-153、Arg-191、Trp-192、Gly-230這4個氨基酸形成氫鍵結合到MAPK1，結合能為-8.08 kJ/mol，與活性位點附近的Tyr-13、Leu-8、Gly-12、Asp-17、Cys-14這5個氨基酸形成氫鍵結合到EGF，結合能為-7.59 kJ/mol;兒茶素與活性位點附近的2個Tyr-199及Gln-61、Lys-98這4個氨基酸形成氫鍵結合到TNF，結合能為-7.59;金絲桃苷活性位點附近的2個Glu-116、Ser-99以及2個Tyr-119這4個氨基酸形成氫鍵結合到TNF，結合能為-7.59，分子與蛋白之間具有強烈的結合活性。分別選擇5個關鍵靶點蛋白具有最低結合能的藥效成分繪制對接模式圖。見圖7。

3 討論

杜仲屬中醫補陽藥，具有補肝腎、強筋骨之效，在臨床使用廣泛，療效顯著。但杜仲為單科、單屬、單種類植物，新藥源的開辟只能從其自身其他部位入手，故杜仲葉能否代替杜仲皮是目前杜仲新藥源的研究熱點。本研究基于中藥-靶點-基因-疾病的研究思路，應用網絡藥理學及分子對接技術，從微觀角度來闡述杜仲葉治療OP的分子作用機制，為臨床能否使用杜仲葉來代替杜仲皮治療OP提供理論依據。

本研究通過TCMSP檢索及查閱文獻共篩選得到杜仲葉7個有效成分，即山柰酚、兒茶素、槲皮素、綠原酸[14-15]、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷[16]、金絲桃苷[17]可能具有防治OP的作用;對應活性成分較多的11個靶點MAPK1、STAT3、VEGFA、IL6、TP53、EGF、AKT1、JUN、MAPK8、EGFR、TNF可能為杜仲葉治療OP的關鍵作用靶點。黎海霞等[18]通過GWGS（Genome-wide Global Significance）芯片整合分析識別篩選出10個外周血細胞中與OP相關的樞紐基因，其中AKT1基因是度最大的樞紐基因，其影響著破骨細胞和成骨細胞的功能;Zhang等[19]對原發性OP的治療候選基因做了表達譜的分析，根據PPI網絡及其子網絡，得出了EGFR、AKT1和轉錄因子CTNNB1是程度較高的關鍵節點，其與成骨細胞分化及破骨細胞形成密切相關，可作為OP的治療靶點。骨代謝生化指標臨床應用專家共識（2020）中認為IL-6能夠對成骨細胞和破骨細胞的生長和功能進行調節，其與OP的發生密切相關，IL-6升高可作為機體破骨細胞功能活躍的標志[20]，并且有研究表明，OP外周血血清中IL-6的表達水平升高，且與OP患者骨密度降低程度正相關[21]。TNF具有TNF-α與TNF-β 2種亞型，而TNF-α由活化的單核巨噬細胞產生，占TNF總活性的70%～95%，目前常說的TNF多指TNF-α，而TNF-α是重要的破骨細胞調節因子，其與OP的發生密切相關。一項關于TNF-α基因多態性與骨密度和骨質疏松風險的Meta分析結果顯示，TNF-α基因G308A多態性可作為篩選、診斷和治療OP的潛在候選生物標志物，有助于提高臨床對OP患者的個體化治療水平[22]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）在體內或者體外環境中分化為成骨細胞，而TNF-α通過核因子κB信號轉導通路損害BMSCs的成骨作用[23]，Yuan等[24]研究發現杜仲葉提取物的主要黃酮類成分槲皮素能夠通過拮抗TNF-α而改善大鼠的骨質疏松。VEGFA是VEGF家族的同源基因，已有研究證實原發性成骨細胞中存在功能性VEGF受體，使VEGF在促進成骨細胞增殖和骨重塑中發揮作用[25]。最近的一項研究也表明，在BMSCs中，VEGFA過表達可增強細胞活力和增殖，Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白表達水平明顯上調[26]。Min等[27]研究表明VEGFA也在破骨細胞分化中發揮作用。c-Jun是與細胞增殖相關的原癌基因，是調控細胞分化和發育的即刻早期基因，亦稱為快速反應基因，c-Jun基因產物直接與成骨細胞增殖和破骨細胞的分化、成熟及功能密切相關[28]。環氧合酶-2（COX-2）亦稱為誘導型前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2），Chen等[29]研究發現敲除感覺神經中的前列腺素E 2受體4（EP4）或者成骨細胞中的COX-2基因可顯著降低成年小鼠的骨骼體積。而表皮細胞生長因子（EGF）控制促炎信號轉導并調節BMSCs的增殖，Müller-Deubert等[30]研究表明表皮生長因子是BMSCs的機械增敏劑，它可能與健康的骨重建和骨折愈合有關。MAP激酶負責轉錄因子c-Jun在細胞核內的特異性磷酸化，是c-Jun氨基端激酶。因此，MAP激酶也被稱為c-Jun氨基端激酶（JNK），JNK是與破骨細胞發生相關的最關鍵的通路之一[31]。Lee等[32]用甲基乙二醛處理RAW264.7巨噬細胞，發現JNK是最有可能參與激活破骨細胞的因子。

GO富集分析結果顯示杜仲葉有效成分的活性靶點是通過影響含氮化合物的合成，細胞及成分遷移運動，蛋白酶及蛋白激酶的活性等方面來防治OP的發生的。KEGG富集分析結果顯示動脈粥樣硬化信號通路、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路可能是杜仲葉防治OP的主要通路。動脈粥樣硬化信號通路及TNF信號通路下游通路包括核因子κB號通路、MAPK信號通路、凋亡信號通路等。Yin等[33]研究發現甘氨酸可以抑制破骨細胞形成和骨吸收功能，并能部分抑制去卵巢小鼠的骨質疏松，而這些作用主要是通過抑制RANKL誘導的核因子κB、ERKB和JNK 3條通路的激活來實現的。MAPK信號通路對于破骨細胞的形成和活化具有重要作用，沈云玲等[34]研究發現阿侖膦酸鈉可能通過調控核因子κB和MAPK信號通路產生抗OP的作用。季康等[35]研究發現唑來膦酸注射液聯合降鈣素治療老年性骨質疏松療效顯著，可降低血清IL-6、TNF-α水平。PI3K-AKT信號通路是細胞凋亡的重要通路，毛滔等[36]研究發現lncRNA NEAT1可能通過抑制PI3K/AKT/Bcl-2信號通路促進OP。李運江[37]研究認為IL-17對成骨細胞生長起消極作用，不通過自噬介導，IL-17負向調控成骨細胞的分化，可能部分通過自噬作用介導。鐘航等[38]研究發現HIF-1信號通路參與了小鼠絕經后OP的病理學改變，抑制HIF-1信號通路可改善PMOP的嚴重程度，而PMOP破骨細胞內HIF-1信號通路的上調可能與AKT、ERK、核因子κB這3條信號通路有關。這些富集度高的信號通路主要通過減輕氧化應激損傷、抑制破骨細胞形成、促進成骨細胞形成等作用發揮防治骨質疏松作用。

綜上所述，杜仲葉對治療OP具有多成分、多靶點、多通路的治療特點;同時也啟示我們在治療OP方面，杜仲葉可能能夠作為杜仲皮的替代品;但是上述研究也存在一定的局限性，需要基礎研究及臨床試驗的進一步確證。

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（2021-02-24收稿 本文編輯：魏慶雙）