靶向野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶潛在活性小分子的發現

姜德文 吳明凱 張永豪 龍治峰

摘要：目的 運用分子對接技術發現靶向野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的潛在活性小分子。方法 選取野生型（WT）和S94A突變型（S94A）Enoyl-ACP還原酶蛋白作為受體，運用Autodock vina從Specs和Chemdiv商業數據庫中篩選具有抗結核潛力的雙靶向野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶活性小分子。結果 與野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶結合親和力排名前2300的小分子共12個。結論：小分子AK-968/12686317和S035-0495是潛在的靶向野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶活性小分子。

關鍵詞：S94A突變型;Enoyl-ACP還原酶;分子對接，結核分枝桿菌

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種慢性疾病。2020年全世界結核病新發生987萬例，發病率達0.127%，死亡率達0.017%。中國作為結核病高負擔國家，結核病新發生84.2萬例，高居世界第二位，發病率高達0.059%，死亡率達到0.0021%[1～2]。目前針對結核病常用的藥物主要有異煙肼、鏈霉素、利福平等。然而，隨著藥物的廣泛運用，耐多藥結核病已經是全世界共同面臨的重大公共衛生新挑戰，嚴重阻礙了結核病的治療和防控[3]。

隨著核心一線抗結核藥物利福平和異煙肼耐藥的發生，開發新型抗結核藥物減少耐藥的發生迫在眉睫[4]。異煙肼被認為是結核病化療的基石，探究其抗結核作用機制，特別是分子耐藥機制，將有助于正確選擇抗結核藥物，并將促進新型靶向抗結核藥物的發現和開發[5～7]。Enoyl-ACP還原酶（Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase）是異煙肼的作用靶點，當氨基酸絲氨酸（S）94突變成甘氨酸（A）后，會導致結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥[8～9]。如果設計一些同時抑制野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶的小分子，將較好地緩解Enoyl-ACP還原酶S94A突變引起的結核分枝桿菌的耐藥問題。本研究采用分子對接方法，篩選同時與野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶具有較好結合親和力的小分子，為抗結核分枝桿菌Enoyl-ACP還原酶發生S94A突變提供一定的參考依據。

1方法

（1）野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶受體準備

從PDB數據庫中分別提取野生型S94A Enoyl-ACP還原酶（PDB ID：2B35）和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶（PDB ID：2NV6）蛋白-配體復合物三維結構，運用pymol軟件去掉水分子，運用AutoDockTools1.5.6進行蛋白準備，加氫并以配體為核心定義20*20*20的盒子大小為活性位點。

（2）配體準備

配體小分子選取Specs和Chemdiv商業數據庫的小分子，經過優化加氫處理后，再用OpenBabel進行切割，將小分子sdf格式轉成pdbqt格式文件，且每個小分子以數據庫的名字命名，即獲取準備好的配體。

（3）分子對接

運用Autodock Vina將準備好的小分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶進行分子對接，通過對接打分判斷小分子與蛋白的結合強弱，選取對接打分排名前2300的小分子進行分析。

2結果

2.1 小分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶結合情況

分別選取與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶對接打分靠前的N084-1026、G194-0411和4296-0065等2300個小分子進行疊合，發現有12個小分子是重復的（見圖1），即提示這12個小分子同時與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶有較強的親和力。它們分別為小分子N084-1026、715-0286、AE-848/11829359、4296-0065、2188-1976、AK-778/11278028、G843-0635、G194-0411、4552-4269、T425-1160、AK-968/12686317和S035-0495。

2.2 潛在活性分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶相互作用模式

為了進一步找到最具有潛力去抑制野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的小分子，本研究比較了12個小分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的對接打分結果，如圖2所示，這些小分子與野生型Enoyl-ACP還原酶的對接打分在-7.2 kcal/mol ～ -10.0 kcal/mol之間，與突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的對接打分在-6.8 kcal/mol ～ -9.6 kcal/mol之間。通過統計結果顯示，對接打分同時優于-9.5 kcal/mol的小分子為AK-968/12686317和S035-0495。

結合以上對接打分所得到的結果，本研究考察了排名靠前的小分子AK-968/12686317和S035-0495分別與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的相互作用模式（見圖3）。在野生體系中，小分子AK-968/12686317與Enoyl-ACP還原酶的Met98形成兩個氫鍵，與Try158形成π-π堆積作用;在S94A突變體中，雖然氫鍵消失，但是AK-968/12686317的疏水端與Phe149和Trp222形成強的π-π堆積作用。小分子S035-0495在野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶中，均能形成較強的氫鍵作用。此外，疏水性苯環插入由Phe149、Tyr158和Ile215組成的空腔中，能夠增強它們之間的作用。

3 結論

結核病是一種主要以呼吸道傳播途徑引起的慢性疾病，因其治療周期較長，會對患者造成極大的精神和經濟負擔。由于預后療效不良、失訪率較高等因素影響，導致結核病發病率在近年來呈現上升的趨勢，尤其以耐藥性結核病較為多見[10～11]。耐藥性結核病防治困難重重，尋找靶向抗結核藥物是臨床亟待解決的關鍵問題。鑒于以上的需求，本課題以一線抗結核經典藥物異煙肼對結核分枝桿菌的作用為切入點，設計同時對野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶都具有抑制作用的小分子來解決結核分枝桿菌的耐藥問題。

本研究通過運用分子模擬技術在PDB蛋白質結構數據庫中找到同時與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶有較強親和力的12個活性小分子，再選用Autodock Vina進行分子對接，以考察12個活性小分子分別與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶之間的相互作用后，顯示AK-968/12686317和S035-0495

小分子是潛在的野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶抑制劑。

綜上所述，為了有效遏制耐藥性結核病例的發生，必須積極尋找到相關靶向藥物，尤其是找到活性小分子靶向作用于耐藥性結核病的突變靶點。本研究發現的AK-968/12686317和S035-0495可能是較為有效抑制耐藥性結核的活性小分子。

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