基于網絡藥理學及分子對接技術研究白頭翁治療肺癌的潛在作用機制

高宇 高秀麗 岳麗玲

【摘要】目的：探尋白頭翁治療肺癌的物質基礎及潛在的作用機制，為肺癌的中醫藥治療提供參考。方法：通過 TCMSP 及 Swiss Target Prediction 數據庫檢索白頭翁活性成分及作用靶點;通過 OMIM 和GeneCards數據庫篩選肺癌疾病靶點;采用 DAVID 數據庫對白頭翁的作用靶點進行 GO 功能和 KEGG 信號通路富集分析;使用 Auto Dock Vina 軟件對白頭翁核心成分與靶蛋白進行分子對接驗證。結果：白頭翁與肺癌交集靶點共21個，主要富集在33個 GO 生物功能和50條 KEGG 通路，分子對接所得結合能均較低。結論：白頭翁通過調節細胞增殖和凋亡等功能，并影響 VEGF 和 p53等信號通路發揮其抗癌作用，可為肺癌的基礎實驗與臨床研究提供理論依據。

【關鍵詞】白頭翁;網絡藥理學;肺癌;機制;活性成分

【中圖分類號】S858.28? 【文獻標識碼】A? 【文章編號】2096-5249（2022）14-0001-0004

To study the potential mechanism of pulsatilla pulsatilla in the treatment of lung cancer based on network pharmacology and molecular docking technology

Gao Yu1，Gao Xiu-li1，Yue Li-ling2△

1.Jiamusi University，Jiamusi 154000，China

2.Qiqihar Medical College ，Qiqihaer 161006，China

【Abstract】Objective：To explore the material basis and potential mechanism of Pulsatilla pulsatilla in the treatment of lung cancer，and to provide reference for the treatment of lung cancer with TRADITIONAL Chinese medicine.Methods：The? active? components? and? Target? were? searched? by? TCMSP? and? Swiss? Target? Prediction database.Lung? cancer? targets? were? screened? by? OMIM? and? GeneCards? databases. DAVID? database? was? used to analyze the GO function and KEGG signal pathway enrichment of the target of Pulsatilla pulsatilla.Auto Dock Vina was used to verify the molecular docking between core components and target protein of Pulsatilla pulsatilla. Results：There were 21 targets for the intersection of Pulpaeatum and lung cancer，which were mainly enriched in 33 GO biological functions and 50 KEGG pathways，and the binding energy obtained by molecular docking was low. Conclusion：Pulsatilla pulsatilla plays an anticancer role by regulating cell proliferation and apoptosis and in?uencing VEGF and p53 signaling pathways，which can provide theoretical basis for basic experiments and clinical studies of lung cancer.

【Key words】Pulsatilla pulsatilla;Network pharmacology;Lung cancer;Mechanism;The active ingredient

肺癌是全世界最常見、最致命的惡性腫瘤之一，目前，肺癌死亡率呈逐漸上升趨勢，嚴重危害人類生命。也是全世界癌癥相關死亡的主要原因。對疾病生物學的普遍了解的實質性改善、預測性生物標志物的應用以及治療的改進使許多患者取得了顯著的進步并改變了許多患者的預后。此外，降低吸煙率也有助于降低高收入國家的肺癌發病率和提高患者生存率。近年來，男性肺癌發病率的下降速度是女性的兩倍，反映出女性吸煙和戒煙的歷史延遲。然而，低收入國家的新肺癌確診病例繼續增加，這些國家的戒煙倡議落后，獲得保健服務的機會很少[1]。此外，從未吸煙的人也會被診斷為肺癌。因此，我們要特別關注肺癌的篩查、診斷和治療的進展。

西醫治療肺癌的方法包括手術、化療、放療和免疫治療，其中化療治療效果較顯著，能提高患者的生活質量 [2]。但化療的同時，會導致患者的正常細胞受到損傷，可產生胃腸道反應、骨髓抑制和口腔黏膜損傷等較嚴重的副作用。因此，肺癌患者進行化療時，臨床上多采用中藥或中藥復方進行輔助治療，在防治肺癌的過程中彌補西醫治療的缺點和不足，提高患者生活質量并延長患者的生存期。中醫藥作為綜合療法的一部分，受到了廣泛的研究關注。因此，研究肺癌早期轉移的分子機制，結合新的中醫藥治療方法和抑制非小細胞肺癌轉移的藥物，可能是治療非小細胞肺癌的一條有前途的途徑。

白頭翁（Pulsatilla radix）在中國已有兩千多年的藥用歷史?！爸袊幍洹庇涊d它來源于毛茛科白頭翁的干燥根，白頭翁的根具有增強免疫功能作用、抗氧化、抗炎、抗腫瘤的藥理作用。目前，白頭翁治療肺癌的藥理作用已有相關報道[3]，但其系統性藥理學研究較少，尚未完全闡明其抗肺癌的藥用有效成分及分子作用機制。本文通過網絡藥理學研究方法，構建“藥物- 成分 -靶點”網絡，探究白頭翁治療肺癌過程中發揮作用的關鍵靶點和相關分子網絡調控機制，可為白頭翁治療肺癌的體內外實驗和臨床研究提供新的思路和方向。

1? 材料與方法

1.1? 白頭翁藥效成分篩選與靶點預測

以“白頭翁”為關鍵詞，在TCMSP（TCMSP：http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平臺及 Swiss Target Predictio n （http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫篩選有效成分及靶點，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫對有效成分作用靶點進行篩選和標準化命名為基因名。并在 Cytoscape3.7.2軟件中，構建“藥物- 成分- 靶點”網絡，進行可視化拓撲分析。

1.2? 預測肺癌疾病靶點

以“Lung Cancer”為關鍵字，在Genecards和OMIM數據庫檢索肺癌靶點并去除重復值，建立肺癌疾病靶點數據集。利用Venn軟件繪制“藥物- 疾病”共同靶點圖，其交集部分可認為是白頭翁治療肺癌的候選靶標。

1.3? 靶點相互作用網絡構建

將交集靶點輸入 STRING（https：//string-db.org/）平臺，繪制共表達靶點蛋白質- 蛋白質互作網絡（PPI）。? 1.4? 靶點富集分析

將1.2中得到的交集靶點輸入 DAVID 數據庫，分析GO 生物過程和KEGG 信號通路。并在SangerBox網站對數據進行繪圖及可視化分析。

1.5? 分子對接

將1.5項下篩選的10個核心靶點與白頭翁主要活性成分進行分子對接驗證。根據Pubchem數據庫獲得白頭翁活性成分的結構，從 PDB（https：//www.rcsb.org/） 數據庫中獲得作用靶點的晶體結構信息（PDB：CASP- 4 PS0，ERS1-3 P86，JUN-2 G01），利用AutoDock Vina 軟件進行分子對接以驗證預測結果的可靠性，計算出活性成分與靶蛋白的最小結合能。

2? 結果

2.1? 收集白頭翁活性成分與潛在靶點

通過檢索TCMSP 數據庫共獲得8個有效成分和73個藥物成分作用靶點，包括Sitosteryl acetate（谷甾醇乙酸酯）、Aureusidi n（金魚草素）、層粘連蛋白（LAN）、鋅指蛋白（ZINC01615307）、Mairi n（丁子香萜）、Isorhamneti n （異鼠李素）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）和 Stigmasterol （豆甾醇）。將上述藥物、成分及靶點數據輸入到 Cytoscape3.7.2軟件中，獲得藥物- 成分- 靶點網絡圖。

2.2? 收集肺癌疾病靶點

利用GeneCards和 OMIM 數據庫，獲得與肺癌疾病靶點信息共1021個，將這些靶點定義為肺癌疾病的相關靶點。利用 Venn 圖軟件獲得白頭翁藥物與肺癌交集靶點共21個。

2.3? 靶蛋白相互作用PPI網絡

將交集靶基因輸入到STRING 數據庫中進行分析。PPI 網絡中有20個節點，96條邊，平均度值為9.14，這充分體現了疾病機制的交互復雜性以及中藥治療疾病的機制特點。將 STRING 數據庫中得到的結果輸入到 Sytoscape3.7.2中，利用其中的SytoHubba插件篩選hub 基因，選擇 Degree 算法篩選出前十位的 hub 基因，分別為：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP3，CASP8， CASP9）、前列腺素 G/H 合酶（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）、轉錄因子 p65（RELA）、雄激素受體（AR）、轉錄因子 AP-1（JUN）和 RAS 相關蛋白Rab-28（PGR）及 ESR1。表明這些靶點在互作網絡中具有重要作用，可作為白頭翁治療肺癌的重要預測靶標。

2.4? GO功能與KEGG信號通路富集分析

將21個交集靶基因提交至 DAVID 數據庫進行 GO 功能和 KEGG 信號通路富集分析，P <0.05。涉及 GO 功能共33個，其中生物過程（BP）22個，細胞組成（CC）4個，分子功能（MF）7 個。其主要的 GO 功能包括細胞增殖及凋亡、調節線粒體膜電位和轉錄激活活性等。涉及 KEGG 信號通路共50條，主要包含肺結核、腫瘤壞死因子、VEGF、P53和小細胞肺癌等通路。

2.5? 分子對接

為了驗證預測結果的可靠性，本研究選擇白頭翁治療肺癌的蛋白互作網絡中度值較高的3 個核心靶點 JUN、CASP3和 ESR1與 8個化合物進行分子對接（見圖1），計算活性成分與核心靶點的結合能均低于-5.0 kcal/mol，表明所篩選的藥物成分與靶點之間具有很好的結合活性。靶點 JUN 與 ESR1與化合物 LAN、ZINC01615307和 Stigmasterol 的結合能小于 -9.0 kcal/mol，表明白頭翁的多種活性成分可能通過作用于以上靶點參與肺癌的治療。

3? 討論

我國名貴中藥白頭翁用藥歷史悠久，早在《神農本草經》[4]中就有記載，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、促進免疫等作用。遠處轉移是早期肺癌患者死亡的主要原因，白頭翁皂苷 E 抑制 A549細胞的增殖、遷移和侵襲[5]。白頭翁皂苷 D 通過調節 AKT/mTOR 信號通路抑制人結腸癌細胞的發展。

本研究通過白頭翁有效活性成分的挖掘，發現白頭翁中主要活性成分包含：豆甾醇、β-谷甾醇和異鼠李素等，提示這幾種有效成分在治療肺癌中發揮著重要的作用。豆甾醇是植物甾醇中的一個重要組分，既往研究證實植物甾醇能降低腫瘤發病風險、遏制腫瘤細胞生長、促凋亡和調節免疫活性。有研究表明，β-谷甾醇可通過上調 p53、Bax基因表達而誘導肺癌細胞凋亡，表明植物甾醇能降低腫瘤發病風險、遏制腫瘤細胞生長、促凋亡和調節免疫活性[6]。在 Lewis 肺癌小鼠模型中發現白頭翁具有很強的抗腫瘤活性。其在體外和體內抑制人肝細胞癌和胰腺癌細胞的生長。分子研究表明， PSA 可能誘導 DNA 損傷，導致細胞 G2/M 期停滯和細胞凋亡。有研究表明，β-谷甾醇可通過上調 p53、Bax基因表達而誘導肺癌細胞凋亡[7]，異鼠李素可能通過上調凋亡基因Bax、caspase-3和 p53的表達，下調Bcl-2、Cyclin-D1和 PCNA 表達的機制有關，誘導肺癌A549細胞凋亡[8]。另外，官紫祎[9]等發現白頭翁皂苷抑制肺癌NCI-H460細胞的增殖并可能干預 MAPK 信號通路及調控 CASP 途徑誘導其凋亡。我們對白頭翁治療肺癌的預測結果與當前相關研究結果基本一致，證明預測的可靠性，所以豆甾醇、β-谷甾醇和異鼠李素等可能是白頭翁治療肺癌的主要有效成分，具有潛在的研究價值。

靶蛋白相互作用 PPI 網絡篩選 CASP3、CASP8、 CASP9、NOS2、ESR1和 MAPK14等為白頭翁治療肺癌的核心靶點。CASP3可能作為潛在的干預靶點而促進腫瘤細胞凋亡[10]，其誘導 PAC-1與順鉑聯用而協同誘導肺癌細胞凋亡[11]。CASP8影響 T 細胞的活性和增殖，在治療肺癌中發揮著重要作用[12]。研究發現 NOS2基因（CCTTT）n 多態性的長等位基因與非吸煙者中的肺癌發病風險降低相關[13]，NOS2的高表達可被認為是治療非小細胞肺癌良好的預后指標。ESR1能有效地抑制細胞凋亡促進肺癌細胞異常增殖，ESR1信號的激活被證明與肺癌細胞的間質和耐藥特征相關[14]。MAPK14對肺癌細胞 H1299具有放射增敏作用，在細胞分化和增殖等過程中具有重要影響[15]。以上研究均表明 CASP3等靶點與肺癌的發生發展密切相關，是白頭翁治療肺癌的重要靶標。

GO 生物學過程富集分析證實了白頭翁對細胞增殖調節、細胞凋亡過程、調節細胞因子的產生與炎癥、類固醇、線粒體膜電位的調節、NF-ΚB 信號和轉錄激活活性等生物學過程有一定影響，這些生物學過程在白頭翁治療肺癌所涉及的作用靶點及其相關通路都有體現。在 KEGG 富集分析中，篩選得到與肺癌密切相關的信號通路，如癌癥通路、肺結核、細胞凋亡、 TNF-α、VEGF、p53和小細胞肺癌等信號通路。研究表明， VEGF 是 HIF-1的調控靶基因之一，VEGF 過表達或高表達在非小細胞肺癌和小細胞肺癌中都有報道，在人小細胞肺癌細胞系中也觀察到 VEGF 和磷酸化的 VEGFR2的表達，提示 VEGF 可能通過自分泌機制維持小細胞肺癌的細胞功能[16]。40%～60%的肺癌細胞與腫瘤抑制基因 P53突變有關，這些突變在與煙草相關的肺癌中比在從不吸煙的肺癌中更常見[17]。白頭翁在治療肺癌的機制方面是通過多條通路發揮作用。而且利用分子對接技術對所篩選的關鍵靶點與活性物質進行模擬結合驗證結果的可靠性，所得結合能均較低，具有良好的結合效果，進一步驗證了本文所篩選的白頭翁治療肺癌的關鍵活性物質和核心作用靶點。

綜上所述，本研究為中藥白頭翁的多組分、多靶點協同作用提供了依據，促進了人們對中藥多組分、多靶點協同作用的理解。然而，在未來的研究中，還需要進行體內外實驗和臨床調查，以驗證白頭翁治療肺癌的作用機制。

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（收稿日期：2021-10-28）