抗菌肽多靶點作用抑菌機理研究進展

肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉 軍，周 全

（1.湖南化工職業技術學院 制藥與生物工程學院，湖南 株洲412000；2.中南林業科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙410004；3.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州510641）

感染性疾病是由細菌和病毒等致病微生物感染引起的嚴重威脅公共健康安全的疾病，特別是以金黃色葡萄球菌為典型代表的多重耐藥菌的出現使感染性疾病治療變得更加復雜[1]。在抗生素替代藥物研究中，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）因能使細菌無耐藥性或降低細菌耐藥性而備受關注[2]，由基因編碼的多肽前體通過蛋白酶解激活產生，大多數為陽離子（2~9價），一級結構中—NH2端常富含親水性氨基酸，—COOH端富含疏水性氨基酸，疏水性殘基一般超過30%，在細胞質膜中折疊后可形成疏水殘基與親水殘基，分別位于兩側的雙親和空間結構，可形成α-螺旋和β-折疊等多種二級結構，具有廣譜抗菌活性、熱穩定性好、抗菌活性高、特異性強、有一定細胞選擇性和對哺乳動物細胞毒副作用少等優勢，對細菌、真菌和病毒甚至腫瘤細胞都有良好抑制活性[3]，對生物體主動防御及主動免疫等也有重要作用，有望成為抗菌藥物理想替代品[4]?？咕膶毎哂卸喟悬c單獨或協同作用，研究抗菌肽多作用靶點抑菌機理對抗菌肽構效關系理論與應用研究具有重要指導意義?？咕脑谏矬w內的生理功能[5]見圖1。

圖1 抗菌肽生物學功能Fig.1 Biological functions of antimicrobial peptides

1 細胞壁損傷抑菌機制

細菌細胞壁主要含肽聚糖，真菌細胞壁主要含葡聚糖和甘露聚糖等成分?？咕目赏ㄟ^與細胞壁合成前體分子結合（如脂質II分子帶負電荷的焦磷酸糖[6-7]）或干擾肽聚糖合成[8]，或與肽聚糖和坦酸等細菌細胞壁關鍵組分結合[9]等方式造成細胞壁損傷。如β-defensin 3可與細胞壁合成前體焦磷酸糖結合，抑制細胞壁形成并破壞細胞正常形態，導致胞內容物外溢和細胞死亡[10]；planosporicin通過阻斷肽聚糖合成造成肽聚糖前體異常積聚，使細胞壁合成受阻[11]；LL-37可作用于真菌細胞壁甘露聚糖造成細胞壁受損而表現抑菌活性[12]；Teixobactin通過與肽聚糖前體Lipid II和坦酸前體Lipid III結合抑制細菌細胞壁合成而表現出抑菌活性[13]。

2 細胞膜損傷抑菌機制

細菌細胞膜上富含大量負電荷酸性磷脂，可通過靜電吸附作用與陽離子抗菌肽結合，抗菌肽結構中疏水區域可與細胞膜兩性離子磷脂表面聚集并富集在膜表面[14]。對G-細菌，抗菌肽可與負電荷細胞外膜脂多糖結合形成肽-脂復合物并形成跨膜通道破壞細胞膜完整性；對G+細菌，可與細胞表面坦酸結合并附著細胞表面，通過兩親性結構自聚形成構象簇穿過坦酸、脂坦酸、脂多糖及肽聚糖層等膜表面組分到達細胞膜并造成膜受損[15]。真菌細胞膜中麥角甾醇和鞘脂常為抗菌肽靶受體，如抗菌肽C16-Fengycin A通過抑制細胞膜中麥角固醇生物合成而破壞禾谷鐮刀菌細胞膜結構[16]，DmAMP1與細胞膜中鞘脂甘露糖苷二肌醇磷脂酰神經酰胺相互作用破壞釀酒酵母細胞膜結構[17]。陽離子抗菌肽不易與富含膽固醇及中性磷脂的哺乳動物細胞膜作用，因此，對哺乳動物細胞有一定細胞選擇性[18]?？咕募毎p傷模型主要有如下4種：

2.1 地毯（Carpet）模型

“地毯”模型是抗菌肽細胞膜損傷模型的典型代表?？咕姆肿悠叫形接诩毎け砻嬷p層，當抗菌肽濃度達到閾值后大量集聚在細胞膜表面形成“地毯”式結構，親水端“伸向”水溶液，而疏水端通過靜電吸附集聚于細胞膜表面，集聚濃度達到閾值后破壞細胞膜完整性，使細胞膜脂雙層結構瓦解塌陷[19]，抗菌肽其疏水核心并未嵌入到細胞膜內部，親水區域也無須聚集形成孔道，當聚集到細胞膜表面的抗菌肽達到閾值后，細胞膜瞬間坍塌，細胞膜向內彎曲并引起膜破裂[19]，作用于G-和寄生蟲等抗菌肽常以毯式模型方式進行[20]，如aurein、cathelidicins、indolicidin和LL-37等[21]。

2.2 環孔狀（Toroidal-Pore）模型

抗菌肽分子極性端與細胞膜磷脂分子極性頭部結合，插入到脂質雙層膜并造成細胞聚集，細胞膜結構發生改變，親水域形成孔內側，而疏水域形成孔外側，疏水性區域與磷脂分子頭部基團協同形成“環孔”并在細胞膜上形成孔洞，造成脂質體與胞內生物大分子“外逸”。由于孔洞由抗菌肽與細胞膜脂質分子共同構成，微型抗菌肽也能形成“環孔”，抗菌肽以垂直方式插入細胞膜并使其疏水區發生移位導致細胞膜疏水中心形成裂口，誘導磷脂單分子層持續性向內彎曲形成跨膜孔道[22]，該模型不存在特定肽-肽相互作用，肽與肽之間不干涉[23]，最顯著特征是雙分子層排列，如magainin、LL-37和sticholysin II等[24-26]。

2.3 桶板（Barrel-Stave）模型

桶板模型的抗菌肽分子橫跨細菌細胞膜形成具有中心內腔結構構象簇的跨膜離子通道，包括抗菌肽單體與細胞膜結合、單體間識別、連續多個單體嵌入與聚集、聚集抗菌肽單體以垂直方式排列細胞膜表面形成跨膜微孔4個步驟。其中，抗菌肽單體間識別與聚集是關鍵[24]?？咕囊允鵂钚问酱怪薄案采w”在細胞膜表面并不斷往胞內滲透，在細胞膜上形成類似于木桶狀的中空管腔結構，親水部分朝向桶內壁構成親水通道，疏水區域朝向膜內與磷脂結合，一個抗菌肽分子就相當木桶邊沿上的“木板”，理論上需要至少4個“板”才能有效形成該模型結構?？咕钚噪S抗菌肽分子數量增加而增加，抗菌肽分子越多內容物滲透就越嚴重[27]，可破壞細胞正常滲透壓并誘導細胞凋亡。Alamycin以α-螺旋構象附著、聚集并嵌入磷脂分子，其疏水性區域與磷脂分子疏水核心結合，親水性區域形成跨膜離子通道或跨膜微孔[24]。桶板模型脂質疏水性和親水性排列對細胞膜不會造成嚴重破壞，部分抗菌肽可易位到內質單層進入細胞質并與胞內組分發生相互作用[28]。只有少數抗菌肽可形成桶板模型，如alamethicin、pardaxin和protegrins等[3]。

毯式模型、環孔狀模型和桶板模型抗菌肽對細胞膜的損傷機制見圖2。

圖2 抗菌肽破壞細胞膜作用機制Fig.2 Schematic representation of membrane-active mechanism of AMPs

2.4 “凝聚”（Aggregate）模型

細胞膜中磷脂先形成聚集體，當結合抗菌肽后聚集體形成的平衡態被打破并在細胞膜上出現離子泄露通道，促使胞內離子“逸出”并造成細胞凋亡?？咕姆肿涌筛偁幮匀〈嗵遣⑴c細胞表面Ca2+和Mg2+等金屬陽離子結合而破壞細胞穩定性，也可與細胞內外膜上脂質層結合并破壞膜結構形成“孔洞”[3]，與環孔模型相似，但抗菌肽排列沒有特定方向，以聚集形式形成跨膜，只會增強細胞膜滲透性，不造成膜破裂，以無規則肽-脂質分子聚集形式插入細胞膜形成動態孔道[3]，如maculatin1.1[29]和polyphemusin等[30]。

3 影響胞內生物大分子合成及代謝關鍵酶活性

陳旋等[31]研究發現，抗菌肽P7可抑制DNA復制和RNA合成導致大腸桿菌死亡；PR-39可通過抑制蛋白質與DNA合成以非裂解方式殺滅細菌[32]；人源抗菌肽tPMP-1和aHNP-1進入到細胞后可抑制DNA與蛋白質合成[33]；組蛋白衍生肽Buforin II在不改變膜通透性情況下通過細菌膜轉運并直接與大腸桿菌胞內核酸或與組蛋白H2A結合，使DNA結構松散，削弱堿基堆積力，干擾DNA合成，BuforinⅡ突變體可與RNA相互作用表現更高結合活性，抑菌活性更強[34]。Indolicidin可阻止胸苷摻入到DNA復制過程，也可與細胞脂多糖結合抑制細胞壁合成，或抑制蛋白質生物合成[35]。Apidaecin可結合在細菌表面并轉運進入到細胞質中，通過競爭性與細菌熱休克蛋白結合，進而封閉并抑制伴侶蛋白質輔助眾多未成熟蛋白質加工折疊，表現出良好的抗菌活性[36]。豬源抗菌肽PR-39可抑制胞內氧化酶復合物組裝，導致細胞無法產生活性氧（ROS）并影響正常代謝[37]。部分α-螺旋肽（pleurocidin，dermasep-tin）和富含Pro與Arg的抗菌肽（PR-39，indolicidin）可阻礙（3H）胸腺嘧啶、（3H）尿嘧啶與（3H）亮氨酸在E.coli中表達，通過抑制核酸與蛋白質合成[32]；富含Pro抗菌肽pyrrhocoricin、drosocin和apidaecin可抑制熱激蛋白的ATP酶活性，影響蛋白質的正?？臻g結構形成[38]。Indolicidin能破壞細菌細胞膜且失活DNA拓撲異構酶來抑制DNA合成[39]；Cathelicidin Bac7能靶向核糖體亞基并干擾蛋白質翻譯，但不影響DNA復制和RNA轉錄[40]；HNP-1和HNP-2能干擾細菌核酸與蛋白質合成并抑制周質β-半乳糖苷酶合成，破壞細胞壁完整性[41]；Feglymycin（13肽）能抑制肽聚糖生成酶MurA和MurC活性，影響細胞壁形成[42]。

4 線粒體損傷抑菌機制

線粒體保持一定的膜電位對其正常生物功能發揮有重要作用，若線粒體受損或形態改變，則線粒體電位會下降，一旦膜電位耗盡，細胞凋亡則不可逆轉，可作為線粒體早期損傷的重要表征指標，特別是線粒體介導的細胞凋亡。papiliocin[43]和psacotheasin[44]可改變線粒體電位耗散誘導白色念珠菌凋亡，CGA-N12和CGA-N9也可通過類似機制誘導熱帶念珠菌凋亡[45-46]。線粒體中Ca2+是真核細胞調控關鍵離子，當細胞過度興奮或刺激時，線粒體對Ca2+的吸收會增強并誘導線粒體內膜損傷，使部分細胞凋亡因子（包括Cyt C）發生外溢[47]。核酸內切酶為Ca2+敏感酶，與細胞凋亡晚期染色質濃縮和DNA斷裂密切相關，Ca2+超載誘導產生的ROS可直接作用于核酸并導致細胞核損傷與細胞凋亡[48]。Scolopendin可誘導線粒體吸收過量Ca2+并造成胞內氧自由基過量生成，從而誘導白色念珠菌因自由基過量而出現細胞凋亡[49]。CGA-N12和CGA-N9也可促進線粒體Ca2+吸收，誘導細胞內ROS過量產生并造成細胞凋亡[45-46]。促細胞凋亡因子Cyt C存在于線粒體膜空間，其釋放常視為線粒體外膜受損或通透性改變，是真核細胞程序性死亡重要特征[50-51]。Melittin可增強線粒體對Ca2+的吸收，誘導胞內產生大量羥基自由基（·OH），并誘導細胞凋亡因子（Cyt C）泄漏，從而造成白色念珠菌線粒體和Yca1依賴性凋亡途徑[52]。CGA-N12也可使熱帶念珠菌Cyt C泄漏，通過天冬氨酸蛋白水解酶依賴性途徑誘導細胞凋亡[45]。線粒體負責TCA循環與氧化磷酸化等能量代謝途徑，TCA循環可產生NADH和FADH2等輔酶，氧化磷酸化是利用輔酶生成能量并將質子逆濃度梯度泵入線粒體間隙，形成線粒體內外膜電化學梯度（電勢用于ATP合成）。histatin 5可抑制輔酶I依耐性酶的生物活性（如蘋果酸脫氫酶），抑制三羧酸循環并下調ATP合成酶的亞基（γ鏈），上調參與蛋白質生物合成的關鍵蛋白質表達水平，使胞內生物大分子泄漏，降低細胞的環境適應性并誘導細胞程序性凋亡[53]。LL-37可降低生物氧化呼吸鏈中相關基因的表達，使能量代謝出現障礙，從而表現抑菌活性[54]。常見抗菌肽結構氨基酸殘基序列及抑菌作用機制見表1。

表1 常見抑菌肽結構氨基酸殘基序列與靶點/作用模式Table 1 Sequence and target/action mode of amino acid residues of common AMPs

續表1

5 免疫調節抑菌機制

除直接殺死微生物外，抗菌肽在亞治療劑量下可作為免疫效應分子調動并激活機體免疫細胞抑制或殺滅炎癥[67]。LL-37可在機體感染或促炎因子誘導下，在生物體內組織或器官中表達和釋放至黏膜表面發揮間接趨化作用[68]，LL-37既可直接上調單核細胞趨化蛋白-1和IL-8表達，還可誘導單核細胞（monocyte）產生大量IL-1β，間接誘導白細胞介素和單核細胞趨化蛋白質表達，或上調趨化因子受體CXCR-4、CCR2和IL-8RB表達，招募免疫細胞到感染部位[69]，或抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）活化和Akt信號通路降低了促炎細胞因子分泌，減弱炎癥反應[70]，還可與細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）結合降低內毒素介導的炎癥反應[71]；部分抗菌肽還可趨化免疫細胞至感染部位，如βdefensin hBD1和hBD2可結合單核細胞趨化因子受體并招募T細胞[72]來發揮抗感染作用。

6 展 望

細胞膜對維持細胞滲透壓、控制物質交換、信號傳導和能量生成等生化過程有重要作用，受損后會導致胞內容物外泄與胞外物質進入胞內，改變細胞滲透壓，對細胞正常生理功能產生嚴重影響并誘導細胞凋亡。近年來，陸續報道了許多新型抗菌藥物，但以細胞膜作為效應靶點居多，主要是因為以細菌細胞膜作為抗菌效應靶點可以解決現有抗生素難以徹底殺滅處于減速生長期與休眠期的細菌這一問題[73]；細胞膜結構相對保守和作用于細胞膜的快速殺菌效應也使得以細胞膜作為效應靶點具有天然優勢；此外，由于細菌細胞膜組分與真核生物細胞膜組分的差異，使得以細菌細胞膜作為效應靶點的新藥物研發具有更好的細胞選擇性和安全性，且不易產生耐藥性[74]。但有研究表明，長期使用抗菌肽也可能存在耐藥性[75]。筆者認為，盡管細菌細胞膜是抗菌肽篩選優秀的效應靶點，但也應考慮基于細胞壁損傷、線粒體損傷、胞內生物大分子合成抑制及代謝關鍵酶靶點的新型抗菌肽研發[3]，從而為抗菌藥物的研究提供更多可供選擇的效應靶點。