可溶性大豆多糖與果膠對酸化乳飲料的穩定機制對比

田 浩，何志勇，王召君，秦 昉，曾茂茂，陳 潔

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

酸性乳飲料是以鮮乳或復原乳為原料，添加白砂糖、甜味劑、香精等，經乳酸發酵或直接添加食品酸調配，最終pH在3.8~4.6的含乳蛋白飲料[1-2]。酸性乳飲料按照其加工方式可分為調配型酸性乳飲料和發酵型酸性乳飲料[3]。近年來，酸性乳飲料由于其獨特的風味、口感和豐富的營養受到廣大消費者的喜愛[4-5]。牛乳蛋白由酪蛋白（質量分數80%）和乳清蛋白（質量分數20%）組成，具有極高的營養價值，但酸性條件下乳蛋白沉淀和乳清析出問題始終是這類飲料新產品開發的挑戰[6]。工業上常通過添加穩定劑提高酸性乳飲料的穩定性，目前可用于酸性條件下穩定蛋白質的穩定劑主要有果膠、羧甲基纖維素鈉、SSPS和藻酸丙二醇等[7-8]。

近年來，SSPS由于其黏度低、溶解性好、口感清爽而逐漸受到重視。SSPS是一種從豆渣中提取的陰離子多糖，結構與果膠類似[8-9]，主鏈由聚鼠李糖半乳糖醛酸和聚半乳糖醛酸組成，中性糖側鏈由阿拉伯糖和半乳糖側鏈組成[10-11]。與果膠相比，SSPS的主鏈較短、側鏈較長，結構近似于球狀[12-13]。果膠在酸性條件下穩定乳蛋白的機制非常清晰，即果膠主要基于3種能力使其能夠長期穩定乳蛋白：靜電排斥、空間位阻以及游離果膠提升溶液黏度并形成弱凝膠體系[14-16]。迄今為止，SSPS穩定酸性乳飲料的機制研究相對很少。一般認為，SSPS穩定酸性乳飲料的機制可能是通過靜電作用吸附在蛋白質表面形成復合物，通過中性糖側鏈的空間位阻穩定蛋白質[17-18]。

為此，以脫脂乳為主要原料的調酸型和發酵型兩類常見的不同加工體系為研究對象，通過LUMiSizer不穩定指數、SEC-HPLC復合物形成量、粒徑、ζ電位及貯藏穩定性等指標，對比研究SSPS與果膠對于酸化脫脂乳的穩定機制，并將2種穩定劑對于酪蛋白和乳清蛋白這2種脫脂乳中主要成分的穩定效應進行對照，以期闡明SSPS的穩定機制，為推進SSPS的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SSPS：河南平頂山金晶生物科技有限公司產品；果膠：美國嘉吉公司產品；脫脂乳粉（蛋白質質量分數32%）、酪蛋白（蛋白質質量分數80%）、乳清濃縮蛋白（蛋白質質量分數80%）：新西蘭恒天然集團產品。

1.2 儀器與設備

Nano-ZS激光粒度分析儀：英國馬爾文儀器有限公司產品；LUMiSizer穩定性分析儀：德國LUMi公司產品；Waters 2695液相系統、Waters 2487紫外檢測器：美國Waters公司產品；Protein KW-804（7 μm，1.5×10-7m?，8.0 mm×300 mm）尺寸排阻色譜柱：日本SHODEX株式會社產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備 直接酸化的脫脂乳或者乳蛋白樣品制備：準確稱取一定量的脫脂乳粉、酪蛋白、乳清濃縮蛋白和去離子水，在室溫下攪拌并維持pH 7.0至其充分溶解，溶液蛋白質質量濃度為20 g/L。準確稱取一定量的穩定劑（SSPS、果膠），溶解于70℃的去離子水中，于磁力攪拌器上攪拌至完全溶解。待兩者均冷卻至室溫后混合攪拌，使用質量分數30%的檸檬酸溶液調節體系至pH 4.0。最終酸化后的樣品中的蛋白質為10 g/L，果膠或SSPS的最終質量濃度為2~6 g/L。

發酵酸化的脫脂乳或乳蛋白樣品的制備：分別準確稱取一定量的脫脂乳粉、酪蛋白、乳清濃縮蛋白和去離子水，在室溫下攪拌并維持pH 7.0至其充分溶解，溶液蛋白質為40 g/L。將樣品溶液在65℃殺菌30 min，冷卻至42℃，添加發酵菌種（丹尼克斯505型）至0.05 g/L，42℃恒溫發酵5 h得到發酵乳基。準確稱取一定量的穩定劑（SSPS、果膠），溶解于70℃的去離子水中，于磁力攪拌器上攪拌至完全溶解。將發酵乳基在20 MPa下均質一次，并與穩定劑溶液混合攪拌，使用質量分數30%的檸檬酸溶液調節體系至pH 4.0。最終發酵樣品中的蛋白質為10 g/L，果膠或SSPS的最終質量濃度為2~6 g/L。

1.3.2 LUMiSizer穩定性測定 通過LUMiSizer預測酸性乳清蛋白飲料的長期穩定性。參照Cai等[21]的檢測方法并稍做修改：4 000 r/min離心，輪廓線560張，截圖時間間隔為15 s，光因子1.0，測試溫度25℃，測試光源470 nm，測試時間為140 min。

在明確微課在教學中的優勢后，需要加深對現階段微課教學產生的問題的理論探究，從而更好地解決微課發展中產生的問題，使微課更加有效地應用于日常教學。

1.3.3 復合物形成量測定 通過SEC-HPLC測定復合物形成量[23]，檢測條件：檢測波長220 nm，Protein KW-804尺寸排阻色譜柱，以含有0.1 mol/L氯化鈉的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 4.0）為流動相，1 mL/min的流量等度洗脫，通過復合物在220 nm的紫外吸收信號峰面積表示其形成量。

1.3.4 平均粒徑、ζ電位測定 參考文獻[24]的方法，使用Nano-ZS激光粒度分析儀測定蛋白質溶液的平均粒徑。為避免多種光散射，采用pH 4.0的0.02 mol/L檸檬酸鹽緩沖液對蛋白質溶液進行體積比為1∶10的稀釋。測定參數：樣品折射率為1.590，水的折光率為1.330，測試溫度為25℃。

1.3.5 貯藏穩定性 將制備的樣品于4℃貯藏14 d后拍照觀察。

1.3.6 統計分析 每組實驗至少重復3次，結果通過平均值和標準偏差進行評估。數據統計分析采用SPSS 2.0軟件在P＜0.05水平上進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 LUMiSizer不穩定指數對比

LUMiSizer穩定性分析儀是依據朗伯特-比爾定律和Stoke’s定律，通過離心加速技術評估產品穩定性的一種儀器。該儀器是通過低轉速長時間離心來模擬自然條件下多糖與蛋白質復合物的聚集情況，縮短了測試時間，提高了研究效率。澄清指數是指離心結束后樣品對光的透過量占原始透光量的百分比。澄清指數越高，表明樣品離心后透光量較初始狀態變化越大，樣品的穩定性越差[25]。直接酸化和發酵酸化體系中不同乳蛋白的LUMiSizer不穩定指數見圖1。

乳清蛋白樣品發酵酸化體系的穩定性低于直接酸化體系，見圖1（a）。在添加量為2 g/L時，果膠穩定乳清蛋白的能力遠不如SSPS；但當穩定劑質量濃度提高到4 g/L或者6 g/L時，果膠的穩定能力大幅度提高，其中直接酸化乳的不穩定指數可以降低到0.27；而SSPS的穩定效應盡管也比2 g/L時提升了，但最終穩定效應不如果膠，不穩定指數僅為0.75。

酪蛋白樣品發酵酸化體系的穩定性也低于直接酸化體系，但差異遠小于脫脂乳蛋白和乳清蛋白，見圖1（b）。在添加量為2 g/L時，SSPS和果膠的穩定效果均很差；隨著質量濃度提高到4 g/L或者6 g/L，果膠的穩定效應提升能力也大于SSPS。

從圖1（c）可以看出，脫脂乳蛋白樣品發酵酸化體系的穩定性普遍低于直接酸化體系。對比果膠和SSPS穩定效應可以看出，對于10 g/L乳蛋白飲料體系，無論是發酵酸化乳還是直接調酸的酸化乳，在添加量為2 g/L時，SSPS和果膠穩定效果均很差。2種穩定劑對直接酸化乳蛋白樣品的穩定性均隨著穩定劑添加量的提高而提高，其中果膠的穩定效應大于SSPS；而對于發酵酸化乳蛋白樣品，兩者的效果均不顯著。

圖1 直接酸化和發酵酸化體系中乳蛋白的LUMiSizer不穩定指數Fig.1 LUMiSizer instability index of milk proteins in formulated and fermented acidified systems

進一步對比乳清蛋白、酪蛋白和脫脂乳蛋白的差異可以看出，果膠和SSPS對于酸化脫脂乳蛋白的穩定效應要遠低于酸化酪蛋白和酸化乳清蛋白。文獻顯示，酪蛋白膠束平均粒徑為120 nm，在50~600 nm波動[26]；而乳清蛋白一般粒徑為60 nm[27]。該結果表明，蛋白質酸化時的聚集體粒徑可能會影響多糖的穩定效果。

值得注意的是，6 g/L的果膠對于直接酸化脫脂乳蛋白與發酵酸化脫脂乳蛋白的穩定性差異巨大。發酵酸化乳的制作過程是酸化后再加多糖，而直接酸化乳制作時是加多糖后直接酸化，這種制作程序上的差異，會導致在多糖與蛋白質結合時，蛋白質聚集體在溶液中的尺寸不同。一般而言，發酵酸化的蛋白質尺寸要遠遠大于直接酸化的。該結果表明，多糖對于酸化乳蛋白的穩定能力可能與多糖和蛋白質的結合能力以及多糖-蛋白質結合物或者蛋白質聚集體本身在溶液中的穩定性有關。

2.2 復合物形成量對比

為了探究果膠和SSPS兩種多糖與乳蛋白在酸性條件下的結合能力，對乳清蛋白、酪蛋白和脫脂乳蛋白分別在直接酸化和發酵酸化體系中和兩種多糖產生的復合物進行定量研究。Zhao等研究顯示，基于靜電吸附的多糖-蛋白質復合物可以采用SEC-HPLC進行定量檢測[23]。因此，通過SEC-HPLC測定復合物形成量，以直觀表示2種多糖與3種乳蛋白在不同酸化模式下的復合物形成量，結果見圖2。

圖2 直接酸化和發酵酸化體系中乳蛋白的復合物形成量Fig.2 Milk proteins complex content in formulated and fermented acidified systems

對于脫脂乳蛋白體系，2 g/L的果膠和SSPS均難以與酸化脫脂乳蛋白有效形成復合物；隨著多糖質量濃度的提升，SSPS和果膠與直接酸化體系中的脫脂乳蛋白形成的復合物增加，且SSPS形成的復合物數量遠高于果膠。但2種多糖均難以與發酵酸化脫脂乳蛋白形成有效復合物。酪蛋白體系與脫脂乳蛋白的結果很類似。

但對于乳清蛋白體系，結果則完全不同。盡管乳清蛋白與2種多糖形成的復合物比脫脂乳蛋白以及酪蛋白要少得多，但對比兩種多糖可以發現：2 g/L的SSPS也可以與直接酸化的乳清蛋白形成較多復合物，且隨著質量濃度的增加，SSPS與乳清蛋白復合物形成量增加；而2 g/L的果膠則幾乎不與直接酸化的乳清蛋白形成復合物，但4 g/L和6 g/L的果膠與乳清蛋白復合物形成量比SSPS與乳清蛋白復合物形成量要多。

果膠或者SSPS與各種乳蛋白形成復合物的能力與LUMiSizer穩定性分析儀測定不穩定指數的結果并不完全一致。對于直接酸化的乳清蛋白，復合物形成量與LUMiSizer不穩定指數的情況是一致的；而對于直接酸化的酪蛋白和脫脂乳蛋白，SSPS的復合物形成能力均強于果膠，但SSPS的LUMiSizer穩定性均低于果膠。然而對于發酵酸化乳蛋白，盡管復合物形成量不足，LUMiSizer不穩定指數高?？傮w而言，復合物形成量與LUMiSizer不穩定指數相關性很弱。

上述結果表明，酸性條件下多糖與乳蛋白形成復合物的能力可能僅僅是穩定乳蛋白的必要條件而非充分條件，還有其他因素影響乳蛋白在酸性條件下的穩定性。同時，直接酸化體系和發酵酸化體系的巨大差異以及乳清蛋白、酪蛋白和脫脂乳蛋白3種復合物形成量的不一致也表明，酸化后蛋白質聚集體結構尺寸可能會導致多糖-蛋白質復合物形成量有所差異，并導致LUMiSizer不穩定指數也有差異。

2.3 平均粒徑對比

為了探究酸化前后多糖的添加順序對2類蛋白質體系酸化后的多糖-蛋白質復合物的形成能力以及蛋白質本身的聚集體粒徑大小和分布的影響，采用粒徑分布儀測定了直接酸化和發酵酸化體系中不同乳蛋白的平均粒徑，結果見表1。

可以看出，在直接酸化體系中，無論哪一種蛋白質，其粒徑都要遠小于發酵酸化體系。

對于SSPS，隨著添加量的增加，直接酸化的3種乳蛋白體系的平均粒徑都顯著下降；而對于發酵酸化乳，隨著添加量的增加，SSPS也可以有效降低乳清蛋白和酪蛋白的平均粒徑，但難以降低脫脂乳蛋白的平均粒徑。該結果部分印證了圖1~2的結果，發酵脫脂乳蛋白粒徑巨大，這可能是其復合物生成量相對小于其他2種蛋白質，且穩定性也不如其他2種蛋白質的緣故。發酵乳清蛋白粒徑比脫脂乳小但比酪蛋白大，其復合物形成量不足，但穩定性比酪蛋白和脫脂乳蛋白好，說明復合物本身穩定性也是影響整個酸化乳體系穩定性的重要因素。

2 g/L的果膠添加量無法有效穩定體系，這與圖1~2結果一致，既無法有效形成復合物，穩定性也不佳。4 g/L和6 g/L的果膠添加量，對脫脂乳粒徑變化影響很小，但對其穩定性影響很大。果膠黏度比較大，隨著添加量的增加，體系黏度顯著增加。

表1和圖1~2的結果說明，酸化乳蛋白的粒徑是影響多糖-復合物形成的要素之一，在復合物有效生成的前提下，體系黏度可能也是影響體系穩定性的重要因素；在復合物無法有效形成的前提下，體系黏度的作用可能更大。

表1 直接酸化與發酵酸化體系中乳蛋白的平均粒徑Table 1 Average size of formulated and fermented acidified milk proteins

2.4 電位對比

直接酸化和發酵酸化體系中不同乳蛋白的電位見表2。在直接酸化體系中，添加SSPS的蛋白質溶液電位絕對值較小，而果膠穩定蛋白質溶液的電位絕對值遠大于SSPS，這與果膠主鏈上含有更多的半乳糖醛酸有關。當SSPS作為穩定劑時，由于其所帶電荷較少，直接酸化體系與發酵酸化體系中蛋白質溶液的電位并無明顯區別。而添加4 g/L和6 g/L果膠時，發酵酸化體系的蛋白質溶液電位比直接酸化體系的更低，這可能是由于發酵后乳蛋白存在大量聚集物，很難與果膠形成有效吸附，此時溶液存在大量游離的果膠，果膠所帶的負電荷較多。但發酵后的脫脂乳蛋白在添加2 g/L果膠時，電位為5.12 mV，明顯不同于直接酸化時的-11.45 mV，這可能是由于此時溶液中果膠含量較少，因此溶液整體的電位與脫脂乳蛋白自身的電位相似。

表2直接酸化和發酵酸化體系中乳蛋白的ζ電位Table 2 ζ-zeta potential of formulated and fermented acidified milk proteins

2.5 貯藏穩定性對比

不同乳蛋白在4℃下貯藏14 d后的穩定性結果見圖3。2 g/L的SSPS對直接酸化的乳清蛋白具有良好的穩定效果，整體澄清透明。而添加2 g/L果膠的乳清蛋白幾乎完全沉淀；4 g/L和6 g/L的果膠對乳清蛋白也具有良好的穩定效果，但整體透明度較低，這可能與果膠與乳清蛋白形成復合物的粒徑較大有關。SSPS對發酵酸化的乳清蛋白穩定能力較弱，在3種添加量下均有明顯沉淀。但4 g/L和6 g/L的果膠對發酵酸化的乳清蛋白有較好的穩定能力，這可能是由于果膠的高黏度起到了穩定效應。

圖3中添加果膠的乳清蛋白貯藏穩定性結果與圖1是一致的，這說明果膠要穩定酸性條件下的乳清蛋白，不僅需要有效形成復合物，同時需要復合物有高度穩定性。圖3添加SSPS的乳清蛋白的貯藏穩定性結果與圖1并不一致，說明在SSPS穩定酸性條件下的乳清蛋白時，離心穩定性不能表征長期存放穩定性，復合物和平均粒徑可能對于該種多糖更有意義。

圖3 直接酸化和發酵酸化體系中乳蛋白貯藏14 d后穩定性Fig.3 Stability of formulated and fermented acidified milk proteins after 14-day storage

對于直接酸化的酪蛋白，添加2 g/L的SSPS時有少量沉淀生成，添加4 g/L和6 g/L的SSPS時整體澄清透明，具有良好的穩定性。 2 g/L果膠直接酸化酪蛋白時，酪蛋白完全沉淀；添加4 g/L和6 g/L時果膠，酪蛋白整體均一，但透光率較低；發酵酸化的酪蛋白體系結果類似。該結果結合圖2結果進一步說明，如果混合體系不能很好地形成復合物，那么未來酸化乳體系的穩定性也欠佳。另外，該結果結合圖1說明離心穩定性不能表征長期存放穩定性，可能對于酸化酪蛋白體系而言，復合物和平均粒徑更有意義。

對于直接酸化的脫脂乳蛋白，在SSPS作為穩定劑時，3個添加量均呈現均一的體系，無明顯沉淀，但透光率比乳清蛋白和酪蛋白低。當添加果膠作為穩定劑時，2 g/L的添加量不能穩定直接酸化的脫脂乳蛋白；當添加4 g/L和6 g/L果膠時，脫脂乳整體均勻，穩定性良好。對于發酵酸化的脫脂乳蛋白，SSPS在各個添加量下均無法有效穩定其體系，而果膠在2 g/L和4 g/L添加量下也無法有效穩定，只有在6 g/L條件下才能有效穩定。上述結果綜合圖1~2以及表1說明，在復合物有效生成的前提下，體系黏度可能也是影響體系穩定性的重要因素。

3 結 語

以脫脂乳為主要原料的調酸型和發酵型兩類常見不同加工體系為研究對象，對比研究SSPS與果膠對于酸化脫脂乳、酪蛋白和乳清蛋白3種蛋白質體系穩定性的影響。結果顯示，在直接酸化體系中，對于3種乳蛋白，除了2 g/L SSPS無法與酪蛋白形成有效復合物并無法穩定體系外，2~4 g/L的SSPS均能與10 g/L的蛋白質形成復合物，并具有良好穩定效果；而2 g/L果膠對3種乳蛋白均無法有效形成復合物，也不能良好穩定體系，只有在高添加量時（4 g/L和6 g/L）才具有較好的穩定效果。在發酵酸化體系中，SSPS只有在4 g/L和6 g/L添加量時才能有效穩定酪蛋白，對于乳清蛋白和脫脂乳蛋白，所有添加量都無效；而對果膠而言，4 g/L和6 g/L添加量對發酵酸化的乳清蛋白和酪蛋白有較好的穩定能力，但對于發酵脫脂乳，只有6 g/L添加量才能有效穩定。上述結果結合LUMiSizer不穩定指數、SEC-HPLC復合物含量、粒徑以及ζ-電位結果說明，不同多糖對于不同酸化工藝和不同蛋白質形成的酸化乳飲料的穩定機制不同，酸化乳蛋白的粒徑是影響多糖-蛋白質復合物形成的要素之一。在復合物有效生成的前提下，體系黏度可能也是影響體系穩定性的重要因素。離心穩定性不能表征長期存放穩定性，對于直接酸化乳蛋白體系，復合物形成量和平均粒徑可能對預測長期存放穩定性更有意義；對于發酵酸化乳蛋白體系，平均粒徑和黏度可能對預測長期存放穩定性更有價值。