基于惡露不盡模型大鼠的秀山地區特色炮制技術“十三制”香附炮制增效作用研究

陳明容，支世君，商思陽，賈 琳，吳文輝

(重慶市中醫院，重慶 400021)

香附為莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖，始載于《名醫別錄》，列為中品，原名“莎草”[1]。香附之名來源于《唐本草》，稱“莎草根香附子”[2]，原因是其根相附連續而生，可以制香料，故名。古人稱其為“氣病之總司，女科之主帥”，廣泛用于氣郁所致的疼痛，尤善治療婦科病癥和月經不調。香附在歷史上的炮制方法有近50種之多，復制法是其特色，據現有文獻記載可從二制一直延續到九制，可見其臨床地位。本研究課題組通過前期對重慶市中藥炮制技術傳承進行普查時發現，在秀山地區有一種“十三制”法尚未有古籍記載，是當地苗族和土家族獨具特色的炮制技術，歷史上曾廣泛用于渝東南部各區縣，主治婦女產后氣滯血瘀、惡露不盡。在進一步對其炮制工藝和炮制原理進行分析后發現，“十三制”香附采用了四個步驟十四種輔料共奏其理氣、化瘀、止血之功。但是，亦由于其炮制繁瑣，輔料眾多，不適應現代化工業生產而逐漸退出臨床，故其臨床療效如何需要進一步的研究和論證[3]。因此，本研究采用現代中醫證候模型方法，以惡露不盡(功能性子宮出血或子宮遷延性出血)雌性大鼠為模型，對比研究炮制前后的增效作用，為特色中藥炮制技術傳承提供思路和方法。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SD大鼠，雌性性成熟未生育，雄性性成熟，體質量230～250 g，SPF級，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004。

1.2 實驗儀器

HYC-310S醫用冷藏箱(海爾)；Synergy HTX全波段酶標儀(Bio-teck)；超低溫冰箱(Thermo)；TGL-18C-C臺式離心機(上海安亭)；RT-3100C全自動洗板機(雷杜生命科技有限公司)；AXLM1820-2超純水機(阿修羅)；UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津)。

1.3 實驗材料

香附原藥材購買于重慶桐君閣股份有限公司，經重慶市中醫研究院中藥制劑研究所副所長楊敏主任中藥師鑒定為莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖；小茴香、艾葉、澤蘭、香薷、益智、萊菔子均符合《中國藥典》(2020年版)一部性狀要求；宮血寧膠囊(云南白藥集團股份有限公司，0.13 g*18粒/盒，批號：ZH12005)；米非司酮片(上海新華聯制藥有限公司，25 mg*6片/盒，批號：C019200602)；米索前列醇片(上海新華聯制藥有限公司，0.2 mg*3片/盒，批號：C024201001)；大鼠絨毛膜促性腺激素(CG)、大鼠雌二醇(E2)和大鼠孕酮(P)均購于江蘇晶美生物科技有限公司，批號：202012。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備

香附生品：取原藥材，除去毛須及雜質，碾成綠豆大粒塊，或潤透，切薄片，干燥，篩去碎屑。

“十三制”香附：取原藥材適量，將糯稻草灰與東墻土按 1∶10混合，用東流水將此二物調成稀泥狀，煮沸，待冷。將毛香附投入其中，攪拌均勻，浸泡至翻泡。隨即反復攪拌去毛，洗凈泥土和鱗毛，低溫烘至五成干。再用童便適量，浸泡過夜，洗凈，低溫烘至七成干。用小茴香、艾葉、澤蘭、香薷、益智仁、萊菔子共煎汁，濃縮至適量，與童便浸香附共煮至干，低溫烘至九成干。再按糖、姜、鹽、醋四制法制后干透，即得成品。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 宮血寧陽性對照液制備 宮血寧膠囊去殼粉碎，臨用時用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成80.21 mg/mL宮血寧混懸液(相當于成人日服劑量10倍)[4-6]。

2.2.2 供試品溶液制備 將香附生品和“十三制”香附粉碎為粗粉，75%乙醇回流提取2次，每次10倍量，每次提取1 h，后藥渣水回流提取2次，每次10倍量，每次提取1 h，合并4次提取液減壓濃縮至無醇味，0.5%羧甲基纖維素鈉分別配置成92.55 mg生藥/mL (相當于成人日服9 g劑量)、2 776.50 mg生藥/mL(相當于成人日服9 g劑量30倍)和5 553.00 mg生藥/mL(相當于成人日服9 g劑量60倍)混懸液。

2.2.3 米非司酮與米索前列醇溶液制備 將米非司酮片與米索前列醇片分別粉碎成細粉，臨用時用0.5%羧甲基纖維素鈉分別配置成米非司酮1.66 mg/mL和米索前列醇20 μg/mL混懸液。

2.3 造模、分組及給藥

2.3.1 造模 將雌性大鼠與雄性大鼠按雌-雄2∶1合籠，次日晨進行陰道涂片顯微觀察，以發現陰道栓子或游動精子為受孕成功大鼠，記為妊娠第 1天[7-9]。在妊娠第7天的早上和下午分別灌胃米非司酮(8.3 mg·kg-1)和米索前列醇(100 μg·kg-1)，建立大鼠惡露不盡模型(早孕不完全流產、功能性子宮出血或子宮遷延性出血)。

2.3.2 分組及給藥 取受孕成功雌性大鼠90只，隨機分為模型組、宮血寧陽性組、生品(低、中、高)劑量組、“十三制”(低、中、高)劑量組，以正常懷孕為正常妊娠組，每組10只。各組大鼠于造模后次日(妊娠第8天)，除空白組和模型組灌胃給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液外，給予相對應的藥物，1次/d，給藥劑量為1 mL/100 g，給藥前禁食不禁水12 h，持續7 d。

2.3.3 惡露情況觀察及血量采集和測定 各組大鼠于妊娠第7天(造模當天)，在上午給與米非司酮后，同時于陰道內置入定量棉球1個(棉球重 85 mg～100 mg，用塑料薄膜包裹半側，以防血液漏出和尿液返流)，記錄置入時間，并于下午給予米索前列醇后置換新的棉球，記錄置換時間，后續每日分別于置入時間和置換時間將棉球取出，單獨放入離心管中密閉冷藏保存，同時置換1個新棉球于陰道內，連續7 d。

最后一次給藥結束2 h后，每只大鼠尾靜脈取血20 μL，加入4 mL5%NaOH，混勻，待用。將收集的含有大鼠子宮血液棉球離心管，根據出血量的實際情況加適量5%NaOH，反復多次浸漬、擠壓、搓洗棉球，至洗脫液無色為止，收集并記錄洗脫液總量，以5%NaOH 溶液為空白對照，在546 nm 處分別測定浸提液以及大鼠靜脈血的吸光度(A)，并按照以下公式計算惡露血量：

V1=稀釋尾靜脈血所用5%NaOH量(mL)；V2=浸提子宮血所用5%NaOH量(mL)。

2.3.4 血清采集及測定 末次給藥2 h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，離心，取血清，按試劑盒要求進行測定，或-80 ℃保存，備用。

2.4 結果

2.4.1 惡露情況 與正常妊娠組比較，模型組大鼠每日出血量和7 d總出血量均顯著提高(P<0.01)，說明造模成功。給藥干預后，相較于模型組，在每日出血量上，第1天均有少量出血，且各給藥組出血量與模型組相差不大，無統計學差異(P>0.05)；第2-7天，“十三制”香附中劑量組在出血量最多的第2-4日可顯著降低出血量(P<0.05)，但在第5-7日無統計學差異(P>0.05)，而“十三制”香附高劑量組在第2-7日的出血量中出血量均有顯著降低(P<0.05)。在7 d總出血量上，“十三制”香附(低、中、高)均具有顯著降低出量的作用(P<0.05)。其余各給藥組除陽性組外，無統計學差異。見表1、表2。

表1 各組大鼠7 d惡露總血量

2.4.2 生殖激素水平 與正常妊娠組比較，藥物流產后模型組大鼠血清絨毛膜促性腺激素(CG)、雌二醇(E2)和孕酮(P)水平值均顯著降低(P<0.01)。給藥干預后，相較于模型組，“十三制”香附在中劑量下雌二醇(E2)水平得到顯著恢復(P<0.05)，“十三制”香附在高劑量下絨毛膜促性腺激素(CG)、雌二醇(E2)均得到顯著恢復(P<0.05)。其余各給藥組除陽性組外，無統計學差異。見表3。

3 結論

米非司酮和米索前列醇聯合作用于模型早孕大鼠不完全流產模型可造成絨毛膜促性腺激素(CG)、雌二醇(E2)和孕酮(P)顯著低于正常妊娠組。香附經過秀山地區特色炮制技術“十三制”法炮制后可顯著降低惡露出血量，并恢復紊亂的雌激素(CG、E2、P)水平，說明“十三制”法確有炮制增效作用，可用于婦女產后惡露不盡。

4 討論

傳統中藥炮制理論認為香附生用解表止痛、醋炒消積止痛、酒炒通絡止痛、炒炭止血；而秀山地區特色“十三制”法通過糯稻灰、東墻土、童便、小茴香、艾葉、澤蘭、香薷、益智、萊菔子、紅糖、生姜、鹽、醋等十數種輔料炮制的共同作用，亦表現出較強的止惡露作用，通過分析，其可能原因與輔料的作用、炮制的制法和服用方法有密切關系。其中，童便味咸，性寒，能滋陰降火、涼血散瘀，并有治療陰虛火升引起的咳嗽、吐血、鼻出血及產后血暈之功效；艾葉湯浸，固沖任，止下痢，可用于婦人漏血；醋味酸、苦，性溫，具引藥入肝，理氣、止血、行水、消腫、解毒、散瘀止痛等作用；而十三制香附的制法總體可認為是將其所用十數種輔料經過提取后，由香附作為主藥和載體，將所有有效物質集于一身，并以散劑入藥，此相當于用炮制的方法改變了處方藥味繁多的臨床應用形式，更接近于現代的中成藥制備，其更多的炮制增效作用尚待進一步驗證和深入研究。

表2 各組大鼠每日出血量動態觀察

表3 各組大鼠生殖激素水平