王雙樂 劉 歡 倪海濱
(南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院,江蘇省中醫藥研究院,江蘇 南京 210028)
慢性阻塞性肺疾?。–OPD)是臨床常見的肺部咳喘疾病,每年在世界范圍內導致300多萬人的死亡[1],目前COPD的治療目標是減少、減輕癥狀,提高運動耐量,并減少惡化的風險[2]。血府逐瘀湯是中醫活血化瘀代表方,有活血化瘀、行氣止痛之效,在治療COPD方面有其獨特功效[3]。研究表明血府逐瘀湯在一定程度上能夠抑制COPD患者血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)以及核轉錄因子-κB(NF-κB)等細胞因子的表達[4],但具體作用機制尚不明確。炎癥反應是COPD的重要發病機制,研究表明TLR4/銜接蛋白髓樣分化因子(MyD88)/NF-κB信號通路參與COPD氣道炎癥發生[5],血府逐瘀湯是否參與及如何參與此通路控制COPD炎癥反應尚不明確,本研究通過小鼠動物實驗探討血府逐瘀湯對COPD相關炎癥因子及通路蛋白表達的影響。
1.1 實驗動物 SPF級健康雄性C57BL6小鼠60只,體質量20~25 g,購自常州卡文斯實驗動物有限公司,合格證編號:201720637,許可證編號:SYXK(蘇)2016-0018。適應性飼養7 d。實驗設計通過江蘇省中醫藥研究院醫學實驗動物倫理委員會審議同意并批準。
1.2 試劑與儀器 血府逐瘀湯水煎劑:當歸9 g,生地黃9 g,紅花9 g,赤芍6 g,桃仁12 g,川芎6 g,枳殼6 g,柴胡3 g,桔梗5 g,牛膝10 g,甘草3 g。統一由江蘇省中醫藥研究院中藥房提供,由本研究院膏方室熬制,以上中藥飲片加水分別制成1.56、0.78、0.39 g/mL 3種濃度的藥液,灌胃所用藥液需以此濃度當日配制并使用。脂多糖(索萊寶生物科技有限公司ABS38214368),紅梅牌香煙[紅塔煙草(集團)責任有限公司生產,貨號6901028317511],地塞米松磷酸鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業有限公司,貨號X02743),戊巴比妥(國藥集團化學試劑有限公司,貨號X03461),4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司,貨號V900894),蘇木精(武漢百仟度生物科技有限公司,貨號C00400),伊紅(武漢百仟度生物科技有限公司,貨號C00400),PBS磷酸緩沖液(麥克林生物科技有限公司,貨號AR0030),Mouse IL-6 ELISA Kit(賽默飛世爾科技公司,貨號ZC-32446),Mouse IL-8 ELISA Kit(賽默飛世爾科技公司,貨號ZC-32449),Mouse TNF-αELISA Kit(賽默飛世爾科技公司,貨號JM-03277H1),Mouse IL-1β ELISA Kit(賽默飛世爾科技公司,貨號JM-03336H1),Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Interleukin 17(IL-17)(賽默飛世爾科技公司,貨號:ZC-32421),TLR4抗體(金唯智生物科技有限公司,貨號AF7017),MYD88抗體(金唯智生物科技有限公司,貨號AF4283),NF-κB抗體(金唯智生物科技有限公司,貨號ABS131170)等。電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司PL-203],超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物JY92-Ⅱn),臺式高速冷凍離心機(寧波新芝生物Neofuge 15R),全自動研磨儀(賽維爾生物KH-Ⅲ),自動洗板機(美國Rayto RT3100),酶標檢測儀(美國BioTeK Epoch)等。
1.3 模型制備 本實驗采用香煙聯合LPS滴鼻法造模[6-7],將小鼠分別放置在50 cm×35 cm×50 cm的香煙熏箱中,每組10只小鼠,每次同時點燃10支香煙,30 min煙熏完畢后,將小鼠放回籠中繼續正常喂養,每日煙熏2次,持續煙熏120 d。煙熏組小鼠分別于第1、30、60、90天予脂多糖LPS滴鼻,左手固定小鼠,右手持10 μL移液器,從鼻腔內滴入LPS 6 μL。
1.4 分組與給藥 造模結束后分組:10只未進行煙熏的小鼠為空白組,采用尾巴染色標記法編號1~10,44只COPD模型小鼠根據體質量隨機分組:模型組、陽性藥物組、血府逐瘀湯高劑量組、血府逐瘀湯中劑量組、血府逐瘀湯低劑量組,模型組8只,其余各組9只小鼠,尾巴染色編號。血府逐瘀湯成人每日用量78 g,成人體質量按60 kg,人與小鼠之間給藥倍數為9.1,算出小鼠正常給藥劑量為11.8 g/(kg·d),中劑量組為23.6 g/(kg·d),高劑量組為47.2 g/(kg·d),制備不同質量濃度中藥湯劑給藥,從121 d起高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠按高、中、低給藥劑量,采用灌胃方式,每日給藥1次,持續給藥30 d。陽性藥物組予地塞米松腹腔注射,成人60 kg每日用量5 mg,小鼠按9.1倍換算為0.76 mg/(kg·d),從121 d起陽性藥物組小鼠采用腹腔注射,每日給藥1次??瞻讓φ战M、模型組小鼠灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。
1.5 標本采集與檢測 給藥結束后,稱重并記錄各組小鼠體質量,予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,眼球取血。打開小鼠頸前皮膚及胸腔,取雙肺分別置于EP管中加入4%多聚甲醛固定,進行石蠟包埋、切片,左肺用于HE染色,右肺用于免疫組化。1)肺組織HE染色。將用多聚甲醛脫水后的左肺放入二甲苯中脫色,在石蠟中包埋過夜,切片厚度4 μm,放置在載玻片上,60℃烤箱中烘干。依次二甲苯、乙醇、蒸餾水充分浸洗5~10 min脫蠟。蘇木精染色5 min,75%酒精、純水沖洗,放到氨水中浸泡5~10 s,伊紅染色5 min,依次放入95%乙醇、100%乙醇、二甲苯中各5 min。滴適量中性樹膠,蓋上蓋玻片,烘干,顯微鏡下觀察。2)血清炎癥因子檢測。將血液4℃環境中靜置1 h,置于離心機離心,4 000 r/min,結束后取上清液,移液器移于EP管中,采用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)、根據ELISA試劑盒說明檢測小鼠血清中TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、IL-8、白細胞介素-17(IL-17)。3)免疫組化。將多聚甲醛中組織脫水后放入二甲苯中脫色,石蠟包埋,切片,烘干,依次二甲苯、乙醇、蒸餾水充分浸洗脫蠟。脫蠟后的切片加入枸櫞酸修復液進行抗原修復,加入血清封閉,按照試劑盒中操作步驟,加入TLR4、Myd88、NF-κB一抗、二抗,室溫下顯色劑染色5 min,切片后鏡下觀察。
1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。服從正態分布的計量資料以(±s)表示,方差齊者組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,組內比較采用配對樣本t檢驗;方差不齊者采用t′檢驗。計數資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;等級資料采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2.1 各組小鼠肺組織HE染色比較 空白組肺切片支氣管、支氣管形狀規則,血管周圍未見炎性細胞浸潤,血管變形較少,肺泡明顯擴張、塌陷、融合少見。模型組、陽性藥物組、血府逐瘀湯各組小鼠肺切片,氣管可見內皮損傷形態不規則,血管有輕度變形,血管平滑肌增厚、肺泡、血管周圍中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞聚集較多,肺泡有融合、擴張、塌陷。陽性藥物組及血府逐瘀湯低劑量組小鼠變化程度相似,居于空白組與模型組小鼠之間。與陽性藥物組相比,血府逐瘀湯中、高劑量組小鼠小氣道、肺泡、血管結構變化及炎性細胞浸潤改變程度相對較輕。見圖1。
圖1 各組小鼠肺組織形態比較(HE染色,100倍)
2.2 各組小鼠炎癥因子水平比較 見表1。與空白組比較,其余各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17含量均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,陽性藥物組及血府逐瘀湯低、中、高劑量組小鼠肺血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17含量明顯下降(P<0.05);與陽性藥物組比較,血府逐瘀湯低劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17表達水平相近(P>0.05),血府逐瘀湯中、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17含量明顯低于陽性藥物組(P<0.05)。
表1 各組小鼠血清中炎癥因子表達水平比較(pg/mL,±s)
表1 各組小鼠血清中炎癥因子表達水平比較(pg/mL,±s)
注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與陽性藥物組比較,△P<0.05。下同。
IL-17 52.67±10.88 217.47±22.67*136.83±12.13*#131.70±14.69*#102.77±11.61*#△80.74±10.71*#△組別空白組模型組陽性藥物組血府逐瘀湯低劑量組血府逐瘀湯中劑量組血府逐瘀湯高劑量組n 10 8 9 9 9 9 TNF-α 37.77±9.85 183.18±11.58*119.70±11.32*#127.45±8.05*#93.54±9.30*#△83.33±13.92*#△IL-1β 25.56±7.48 163.31±26.49*111.44±12.34*#118.61±12.21*#86.62±12.37*#△70.91±7.82*#△IL-6 18.66±5.62 130.40±9.81*94.15±13.27*#99.66±14.85*#70.92±10.94*#△58.02±10.03*#△IL-8 15.26±5.39 123.80±21.37*86.64±9.59*#85.39±11.44*#63.83±7.92*#△50.86±10.37*#△
2.3 各組小鼠免疫組化比較 見表2,圖2~圖4。通過Image pro-plus6.0圖像分析系統測量TLR4、MyD88、NF-κB免疫組化圖片平均光密度值,進行TLR4、MyD88、NF-κB蛋白含量測定。結果顯示,與空白組比較,其余各組肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB表達水平明顯升高(P<0.05),而通過陽性藥物、血府逐瘀湯干預之后,小鼠肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB表達水平均出現明顯下降(P<0.05);與陽性藥物組小鼠相比較,血府逐瘀湯中、高劑量組各組小鼠TLR4、MyD88、NF-κB表達水平更低(P<0.05)。
圖2 各組小鼠TLR4免疫組化(200倍)
圖3 各組小鼠MYD88免疫組化(200倍)
圖4 各組小鼠NF-κB免疫組化(200倍)
表2 各組小鼠TLR4、MyD88、NF-κB表達水平比較(±s)
表2 各組小鼠TLR4、MyD88、NF-κB表達水平比較(±s)
組別空白組模型組陽性藥物組血府逐瘀湯低劑量組血府逐瘀湯中劑量組血府逐瘀湯高劑量組n 10 8 9 9 9 9 TLR4 0.12±0.01 0.55±0.13*0.33±0.11*#0.38±0.10*#0.28±0.05*#△0.18±0.03*#△MyD88 0.11±0.01 0.44±0.09*0.29±0.04*#0.35±0.09*#0.22±0.04*#△0.19±0.03*#△NF-κB 0.12±0.02 0.53±0.11*0.26±0.05*#0.32±0.07*#0.25±0.05*#△0.21±0.04*#△
隨著生態環境破壞、空氣質量的惡化及吸煙人群的增加,COPD的發病率有著逐漸增高的趨勢,COPD的防治工作存在諸多難題。COPD在中醫上被認為是“肺脹”,肺脹反復發作、日久遷延不愈、氣虛造成無力行血,血行緩慢,久之則成血瘀。最早在《靈樞·刺節真邪篇》中提到“宗氣不下,脈中之血,凝而留止”。巢元方明確指出“諸痰者,皆由血脈壅塞,飲水積聚而不消除,故成痰也”,意為痰液的產生乃血脈不暢、飲入體內的水積聚津液不暢所形成[8]。后世認為痰瘀伏肺是COPD發病的夙根,既是COPD發病因素,也是其病理產物。臨床研究表明血府逐瘀湯能夠在一定程度上抑制COPD患者血清中IL-8、TNF-α以及NF-κB等細胞因子的表達,這可能與血府逐瘀湯中多種藥物的抗炎及免疫調節作用相關[4]。
本課題組通過香煙煙熏聯合LPS滴鼻成功構建了COPD小鼠模型[9],通過觀察小鼠肺組織HE染色切片,可以看到與空白對照組相比,COPD小鼠氣道的變形、肺泡的融合、塌陷、擴張,肺血管平滑肌增生及中性粒細胞聚集等現象明顯增加。通過設置血府逐瘀湯3組不同的給藥劑量,以地塞米松為陽性藥物對照,30 d的給藥后,發現與不干預的模型組相比,陽性藥物組及血府逐瘀湯3組的肺組織鏡下HE染色病理改變有不同程度減輕,炎癥因子表達明顯下降。免疫組化可以看到,與模型組小鼠相比,血府逐瘀湯各組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達下降明顯,尤其是血府逐瘀湯高劑量組,蛋白表達優于陽性藥物組。
TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與COPD氣道炎癥發生[10],Toll樣受體(TLRs)是一組模式識別受體,參與機體的先天免疫系統,它可以識別病原體相關分子模式(PAMPS)[11]。TLR4是TLRs中一種重要的識別受體,有證據證明多種PAMPS可以刺激TIR4[12]。TLR4是LPS的一個重要的傳感器,在識別LPS等PAMPS后,TLR4受體開始募集,并通過相關銜接蛋白傳遞給下游信號[13]。MyD88是一種常見的銜接蛋白[14],可以激活下游的核因子NF-κB。NF-κB是負責調節先天性和適應性免疫應答的主要轉錄因子,控制著炎癥因子的釋放[15-16]。
綜合實驗結果,COPD炎癥反應與TLR4、MyD88、NF-κB等蛋白的高表達相關,血府逐瘀湯可能通過調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路減少了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17等炎癥因子的釋放,參與了COPD炎癥反應的控制。