植物單寧的微生物降解及其調控反芻動物瘤胃發酵的研究進展

申家豪 鄭娟善 梁澤毅 丁學智,2*

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育重點實驗室，蘭州730050；2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業農村部獸用藥物創制重點實驗室，蘭州730050)

我國動物源食品安全正受到生物污染和化學物污染的威脅。隨著2020年國家飼料端“禁抗”，養殖端“減抗、限抗”獸用抗菌藥使用減量化模式的推行，尋找天然綠色、安全的抗生素替代品已成為畜牧業發展的焦點。近年來，單寧作為一種天然綠色的新型飼料添加劑在飼料行業中被廣泛關注。植物單寧(plant tannins)又稱植物多酚，是植物以碳為基礎形成的除木質素以外含量最豐富的復雜酚類次生代謝產物[1]，廣泛存在于五倍子、栗木、茶、葡萄、高粱和咖啡等植物的根[2]、莖[3]、葉[4]、花[5]等部位及種子[6]中。植物單寧可與家畜的唾液蛋白在口腔內發生沉淀反應，并對消化道內的微生物及消化酶產生拮抗，從而降低家畜的采食量和消化率[7]。同時，植物單寧具有廣譜的抑菌性，會降低草食動物對營養物質的吸收率。因此，植物單寧一直以來都被認為是飼料中的抗營養因子。近年來，隨著研究的深入，動物營養學家對植物單寧的抗營養作用有了重新認識。植物單寧產生抗營養作用的主要原因為其相對分子質量較大和添加濃度過高，而在飼糧中添加適量的植物單寧不僅可提高畜禽的采食量和平均日增重、抑制寄生蟲、改善生產性能，而且在維持動物機體微生態平衡及減少甲烷和氮排放等方面也發揮了重要的作用[8]。然而，目前植物單寧在家畜飼糧中的有效添加劑量尚不確定，其微生物降解途徑及調控瘤胃發酵的機理尚不明晰。因此，探究飼糧中植物單寧的適宜添加量與大分子植物單寧的生物降解途徑，從而降低或消除植物單寧的抗營養作用，使其作為添加劑更合理的調控瘤胃發酵成為近年來的研究熱點。本文基于植物單寧的分類及結構、微生物降解植物單寧的機制及單寧降解酶的相關知識，重點闡述植物單寧對瘤胃發酵的調控及甲烷排放等的影響，旨在為植物單寧作為一種潛在的綠色添加劑在調控瘤胃發酵及改善反芻動物機體健康方面提供新的方法和思路。

1 植物單寧及其微生物降解

1.1 植物單寧的分類及結構

作為天然存在的多酚類物質，植物單寧具有多種官能團，其單體單寧酸化學式為C76H52O46，可與蛋白質、少量碳水化合物和多糖等形成各種復雜化合物，因其結構不同，功能也存在差異。植物單寧通常包含水解單寧(hydrolysable tannins，HT)和縮合單寧(condensed tannins，CT)2種類型[9-10](圖1)。水解單寧主要為鄰苯三酚類[10]，其相對分子質量較小，一般為500～3 000[11]，容易被酸、堿和酶水解，進而形成沒食子單寧和鞣花單寧。沒食子單寧常見于豆莢、漆樹葉、栓皮櫟中[12]，可進一步水解產生沒食子酸和葡萄糖[13]；鞣花單寧主要存在于合金歡、板栗、松樹皮、橡木、黑莓、石榴中[12,14]，水解可產生葡萄糖和六羥基二苯甲酸[15]，其中六羥基二苯甲酸可形成鞣花酸等[16]?？s合單寧主要為鄰苯二酚類，最常見的縮合單寧為原花青素(兒茶素和表兒茶素)，其相對分子質量較大，一般為1 900～28 000[11]，主要存在于豆科植物、喬木和灌木中[14]?？s合單寧亞基結合成低聚物和聚合物的方式主要是通過1個黃烷-3-醇單體C-環的C-4位共價連接到其他亞基C-環的C-6和C-8位，最終聚合成較穩定的C6·C3·C6結構，在胃腸道中不易被降解，酸性條件下會進一步縮合成花青素等物質[10-11,17]。過量的單寧可與蛋白質形成不易被消化的復合物，還可與消化酶結合改變消化酶的活性和功能，進而影響家畜的采食量和消化率[18]。近年來，研究發現反芻動物飼糧中添加適量的植物單寧會促進機體對進入瘤胃的營養物質的消化、吸收與利用[19]。

A：水解單寧 hydrolysable tannins；B：縮合單寧 condensed tannins。

1.2 可降解植物單寧的微生物

植物單寧對大多數微生物存在廣譜抑制性，使植物單寧的微生物降解存在一定的困難，但自然界內仍有部分細菌、霉菌以及酵母菌等(表1)對植物單寧存在一定的耐受性，能夠降解不同種類的植物單寧。此外，在反芻動物瘤胃內也發現了部分可降解植物單寧的微生物[20]。

表1 可降解水解單寧與縮合單寧的部分微生物

2 植物單寧的微生物降解機制

2.1 水解單寧

通常條件下，細菌對水解單寧的降解主要是通過其分泌的酶將水解單寧轉化為沒食子酸，沒食子酸通過沒食子酸脫羧酶或沒食子酸羧化酶轉化為鄰苯三酚，然后在氧化酶的作用下氧化斷裂為脂肪酸[27]。然而，由于反芻動物瘤胃內的嚴格厭氧環境，使得沒食子酸降解途徑發生改變，即鄰苯三酚經異構酶轉化為間苯三酚，再經還原酶和水解酶轉化為3-羥基-5-氧己酸并在一系列酶的作用下先轉化為乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，繼而分解生成乙酸酯和丁酸酯[28]。此外，Krumholz等[29]在對水解單寧細菌降解的相關研究中發現，瘤胃中3-羥基-5-氧己酸酯(HOHN)由HOHN-輔酶A轉移酶的酶促作用產生，瘤胃細菌通過β-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙酰輔酶A轉移酶、烯酰輔酶A水合酶、磷酸乙酰轉移酶和乙酸激酶的順序酶促作用轉化為乙酸鹽和丁酸鹽。同時，Nelson等[30]發現一種新的瘤胃細菌(西塞利鐮刀菌)可分解單寧酸和酚類單體，如沒食子酸、連苯三酚、阿魏酸和對香豆酸，經驗證此類化合物的降解途徑與早期研究結果相似，即該類化合物單體首先經乙酰輔酶A還原，最后水解成六碳酮酸。此外，在反芻動物體內，水解單寧經瘤胃和腸道代謝可形成易吸收的小分子代謝物(鄰苯三酚、間苯二酚和間苯三酚)和其他酚類代謝物(兒茶酚、尿石素和尿石素衍生物)[31-32]。然而，通過水解單寧的不完全生物轉化產生的水解單寧代謝物(主要是鄰苯三酚)對瘤胃微生物群落和宿主有不利影響[32]。

可降解水解單寧的真菌大多來源于青霉屬和曲霉屬。不同種屬的霉菌對水解單寧的降解機制大體相同(在單寧酶的作用下，霉菌先將沒食子單寧轉化為沒食子酸和葡萄糖)，卻又不完全一致，如煙曲霉可直接將沒食子單寧轉化為沒食子酸；在黑曲霉中，沒食子酸是可水解單寧的酚類單體，被加氧酶氧化裂解形成不穩定的三羧酸中間體(順烏頭酸、α-酮戊二酸和檸檬酸等)，然后經氧化脫羧產物甲酰烏頭酸脫羧，最終進入檸檬酸循環[33]；而在黃曲霉中，沒食子酸經三羧酸中間體降解為草酰乙酸，最后轉化為丙酮酸[12]。

2.2 縮合單寧

早期研究發現，縮合單寧單體(黃酮類化合物)可被瘤胃液降解[34]。1999年McSweeney等[35]首次發現了以縮合單寧為單一碳源的瘤胃細菌，為之后縮合單寧的細菌降解提供了思路。2009年，Brown等[36]研究發現縮合單寧在厭氧環境中被消化道菌群轉化為芳香中間體，之后生成甲烷。胡文斌等[37]指出瘤胃內黃酮類化合物的降解途徑為：瘤胃微生物將櫟精(黃酮醇)降解為間苯三酚和苯乙酸鹽的衍生物，瘤胃內的厭氧條件促使間苯三酚快速降解，其產物進入三羧酸循環最終生成甲烷和二氧化碳。陳度宇等[38]利用梯度馴化法從牛、羊糞中分離出1株以縮合單寧為唯一碳源的革蘭氏陰性菌，并通過正丁醇-鹽酸法和液相色譜法檢測縮合單寧降解率，72 h后縮合單寧降解率可達90%以上。該研究首次表明革蘭氏陰性菌可以降解縮合單寧為兒茶素，為縮合單寧的細菌降解提供了新思路。

縮合單寧結構復雜，分子中的芳香環以C—C鍵相連，是黃烷-3-醇類單寧的聚合物，自身缺少易水解的沒食子?；Y構，加上空間位阻效應的影響，在反芻動物胃腸道內很難被微生物降解[39]。但研究發現仍有部分真菌可以斷裂縮合單寧分子中的C—C鍵，使其成為黃烷醇單體，然后進一步轉化為酚類和酸類等小分子化合物[40-42]。

3 單寧降解酶

微生物降解植物單寧的實質就是微生物分泌的酶催化植物單寧降解的酶促反應過程[37]。研究發現，微生物能夠分泌使植物單寧發生降解的單寧降解酶，如單寧酶、脫羧酶、多酚氧化酶等[31]。實際上，無論水解單寧還是縮合單寧，本身均含有大量的羧基和羥基等官能團，能夠與蛋白質形成復合物，進而抑制微生物生長，阻礙微生物的代謝過程。單寧-蛋白質化合物的降解包含2個步驟：第1步是單寧-蛋白質化合物分子間的化學鍵受酶的作用率先斷裂，形成游離的單寧；第2步是游離單寧分子中的酯鍵或縮酚鍵在單寧酶的作用下發生斷裂，形成分子質量較小的縮酚酸和多元醇，縮酚酸與多元醇繼續被多酚酶與脫羧酶等酶降解為間苯三酚和間苯二酚，最終轉化為3-羥基-5-氧-己酸、5-氧-6-己酸甲酯等小分子物質[37,43]。

3.1 單寧酶

單寧酶也稱單寧?；饷?TAH)，該酶能夠催化沒食子單寧等底物中酯鍵和縮酚鍵的水解，釋放沒食子酸和葡萄糖[44]。自然界內，動物、植物、細菌和真菌均可分泌單寧酶。其中，用于工業化生產的單寧酶大多源自于微生物[45]。早期研究發現，真菌、酵母菌等微生物均能分泌單寧酶，已被研究發現的可分泌單寧酶的真菌有根瘤菌(Rhizobium)、木霉菌(Trichodermaspp.)等[46]；細菌有芽孢桿菌(Bacillus)、纖維單胞菌(Cellulomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)和腸桿菌(Enterobacteriaceae)等[47-48]。此外，山羊等反芻動物消化道內也分離到單寧降解菌[49]。研究表明，單寧酶的催化作用主要取決于酶-底物復合物(enzyme-substrate compound，ES)的形成[50]。同時，微生物分泌的單寧酶在水解單寧轉化為沒食子酸方面有巨大潛力，但是在反芻動物腸道內的具體作用機制尚不清楚[51]。

3.2 脫羧酶

微生物在降解單寧類化合物的過程中會產生脫羧酶，它可將沒食子酸在脫羧作用下生成焦棓酸，因此也被稱為沒食子酸脫羧酶。研究發現，由反芻動物腸道內篩選的大腸桿菌、鏈球菌等具有較強的脫羧酶活性，可使棓酸脫羧成為焦棓酸，甚至可以直接脫去單寧分子酚環上的羧基形成焦棓酸[52]。比如，水解單寧在單寧酶作用下生成中間產物1，2，3，4，6-黃酰單寧和2，3，4，6-四酰單寧，然后單寧酶催化其分子內酯鍵斷裂產生沒食子酸和葡萄糖，葡萄糖進入三羧酸循環[53]；沒食子酸再通過脫羧酶的作用形成焦棓酸，進而被各類氧化酶還原為間苯三酚、間苯二酚，最終形成3-羥基-5-氧-己酸、5-氧-6-己酸甲酯[54](圖2)。

圖2 沒食子單寧、鞣花單寧的酶促降解過程

3.3 多酚氧化酶

多酚氧化酶是一類廣泛存在于動物、植物、微生物中能夠高效催化多酚類物質氧化的含銅質體的金屬酶類[56]。多酚氧化酶又稱兒茶酚氧化酶、鄰苯二酚氧化還原酶，廣義上可分為2類：1)單酚氧化酶(EC 1.14.18.1)，即酪氨酸酶；2)雙酚氧化酶(EC 1.10.3)，包括兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)和漆酶(EC 1.10.3.2)[57]。植物中的多酚氧化酶一般指兒茶酚氧化酶[58]。有氧條件下，多酚氧化酶可通過2步將酚類物質轉化為鄰醌，其一是現有的羥基發生鄰位羥基化；其二是鄰二羥基苯氧化為鄰苯醌[59-60]。

4 植物單寧對瘤胃發酵的調控

4.1 調節瘤胃微生物并提高飼料轉化率

大量研究表明，植物單寧等植物多酚作為潛在的“替抗”飼料添加劑，可影響瘤胃微生物的生長、代謝和繁殖，進而在調控瘤胃發酵模式，減少甲烷排放，提高反芻動物對飼糧及營養物質消化率等方面表現出巨大潛力[61]。這可能與植物單寧可以選擇性地影響特定的瘤胃細菌，從而改變瘤胃上皮中乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸的吸收和代謝過程有關[62-63]。Díaz Carrasco等[64]指出飼糧中添加單寧降低了瘤胃微生物總豐富度，但沒有顯著影響細菌、古菌等類群相對豐度的平衡。Shabat等[65]發現飼糧中添加單寧會降低瘤胃微生物相對豐度，代謝物輸出種類減少，而特定代謝物數量增多，進而提高了飼料轉化效率(圖3)。此外，飼糧中合適比例的單寧能夠沉淀蛋白質，繞過瘤胃消化，增加過瘤胃蛋白的數量，提高小腸對于蛋白質的吸收率并降低瘤胃液中可溶性氮和氨態氮(NH3-N)濃度，增加宿主對于氮的利用率[64,66]，進而減少能量損失。

圖3 植物單寧對瘤胃微生物豐度、代謝物及飼料轉化效率的影響(參考Shabat等[65]，略有調整)

4.2 調控瘤胃液pH、揮發性脂肪酸(VFA)和NH3-N濃度

瘤胃液pH是衡量瘤胃發酵的一個特征性指標，一般瘤胃液呈中性或弱酸性，瘤胃發酵的最適pH是6.0～7.0，pH低于或超出此范圍均不利于瘤胃微生物的生長和瘤胃發酵等活動的進行[67]，瘤胃液pH降低會抑制產甲烷菌的生長，降低纖維消化率，增加酸中毒的風險[68]。肖敏敏等[69]研究發現，飼糧添加2%的高粱單寧提取物對瘤胃液總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度無顯著影響。同樣，Abdalla等[70]通過體外試驗發現，在綿羊飼糧中添加3%的縮合單寧能夠使瘤胃液中丙酸、異丁酸和異戊酸的比例顯著降低，同時能夠使乙酸和丙酸的比例顯著提高，但是TVFA濃度無顯著變化。楊凱[71]也發現，在肉牛飼糧中添加1.3%和2.6%的單寧酸均能夠顯著降低其瘤胃液內異戊酸和戊酸比例，同時顯著提高丙酸比例，但是對瘤胃液pH和TVFA濃度無顯著影響。但Bueno等[72]通過體外發酵試驗指出，添加5%的縮合單寧會顯著降低培養液TVFA濃度，但乙酸、丙酸和異戊酸等各組分比例無顯著變化。因此，我們認為植物單寧添加量約為3%時不會對瘤胃液pH及TVFA濃度產生顯著影響，但能夠調整乙酸、丙酸、異丁酸和異戊酸等各組分的比例。王敬堯等[73]通過體外培養試驗發現，隨單寧酸濃度的升高，瘤胃液pH呈現下降的趨勢，推測其原因可能是單寧酸抑制了瘤胃微生物的發酵，使VFA濃度降低，進而降低了pH。同時，王敬堯等[73]研究發現，添加單寧酸的試驗組發酵6和24 h的NH3-N濃度顯著低于對照組，且單寧酸添加量越高，NH3-N濃度下降越明顯。由此，我們推測NH3-N濃度的下降可能與植物單寧抑制了瘤胃微生物的活性有關。潘發明等[74]指出，飼糧中單寧酸的添加量低于1.5%DM時能夠顯著提高氮的留存率，反之則會降低?？傊?，飼糧中添加適量的植物單寧可以抑制瘤胃微生物降解，增加過瘤胃蛋白的數量，提高機體對蛋白質的利用效率；減少可溶性氮和NH3-N濃度，提高反芻動物對于飼糧中必需氨基酸和氮的利用效率[65,75]。飼糧中植物單寧添加量的不同對瘤胃發酵的影響也不同(表2)，呈現出劑量效應。因此，探索飼糧中植物單寧的適宜添加量，明晰植物單寧調控瘤胃發酵的作用機制十分關鍵。

表2 植物單寧對瘤胃發酵參數的影響

4.3 對采食量及營養物質消化的劑量效應

與單胃動物不同，反芻動物特有的瘤胃是其消化飼糧中營養物質的主要場所。楊凱[71]研究發現，在飼糧中添加低濃度(0.65%、1.50%)的水解單寧對肉牛中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗蛋白質(CP)的表觀消化率無顯著影響，但隨著水解單寧濃度的不斷升高，肉牛對CP的表觀消化率逐漸下降；當水解單寧濃度達到2.60%時，肉牛對干物質(DM)的表觀消化率顯著下降。Kamel等[78]研究發現，飼糧中添加0.3%的白堅木縮合單寧使得綿羊對NDF、ADF和CP的表觀消化率顯著降低。Kronberg等[79]通過試驗也得到類似結論，隨著飼糧中縮合單寧添加量的增加(0.7%、1.5%、2.9%)，綿羊對DM、NDF、ADF、CP的表觀消化率呈現下降的趨勢。此外，縮合單寧會影響瘤胃蛋白質的消化并呈現出劑量效應，當飼糧中蛋白質含量較高而碳水化合物等其他營養物質含量較低時，縮合單寧會表現出有利的影響[80]；而當飼糧中蛋白質含量不足時，縮合單寧的存在會降低反芻動物對蛋白質的消化率并對反芻動物的健康構成威脅[81]。潘發明等[74]指出，飼糧中單寧酸濃度低于1.5%時，能夠提高對營養物質的消化率；而飼糧中單寧酸濃度高于1.5%時，綿羊采食量降低，對營養物質的消化率也會降低。因此，植物單寧對飼糧中營養物質吸收的促進或抑制作用與其濃度密切相關，植物單寧濃度過高導致其與蛋白質結合形成單寧-蛋白質復合物，從而降低反芻動物對飼糧中營養物質的吸收率。不同類型植物單寧及其添加量對干物質采食量及營養物質消化率的影響也不盡相同(表3)。

表3 植物單寧對干物質采食量及營養物質消化率的影響

4.4 抑制瘤胃甲烷排放

甲烷作為一種溫室氣體，其溫室效應潛力約為二氧化碳的28倍，甲烷產量的增加對全球環境構成嚴重威脅。據統計，反芻動物每年的甲烷排放量約為8 000萬t，可達全球甲烷排放總量的25%[86]，占飼糧能量總損失的5%～9%[87]。大量研究表明，單寧等植物次生代謝物可以調控瘤胃發酵，提高動物生產力，減少甲烷排放等[88]。例如，麗麗等[89]通過研究不同添加量的檸條單寧對綿羊產甲烷菌多樣性的影響指出，不同添加量的檸條單寧均顯著降低了瘤胃產甲烷古菌群落的豐富度與多樣性，這可能是由于單寧率先與產甲烷菌表面的蛋白質相結合，形成了單寧-蛋白質復合物，從而抑制產甲烷菌的生物活性，使得甲烷產量降低[90]。Grainger等[91]發現，在放牧奶牛中添加高水平縮合單寧(453 g/d)時，甲烷產量下降了14%，在放牧奶牛中添加較低水平縮合單寧(244 g/d)時，甲烷產量下降了29%。同樣，Animut等[92]也指出縮合單寧可抑制甲烷排放，且抑制程度與縮合單寧濃度有很大的關系。此外，Saminathan等[93]通過體外試驗指出，瘤胃甲烷產量會隨著銀合歡縮合單寧分子質量的增加而顯著降低，但對干物質采食量的影響不顯著。同時，Tapio等[94]報道稱甲烷產量與原蟲數量之間存在正相關關系，因此原蟲數量的減少會抑制甲烷的生成。而Jolazadeh等[77]在荷斯坦公牛飼糧中添加7.13%的縮合單寧后發現，瘤胃中原蟲數量減少。同樣，丁學智[95]也發現，隨著單寧濃度的增加，瘤胃中原蟲數量呈現降低的趨勢。出現以上結果的原因可能是植物單寧降低了瘤胃細菌的數量，間接影響了原蟲生長所需的氮的供給，從而使得原蟲的數量下降[96]。因此，植物單寧抑制瘤胃甲烷排放的另一個原因可能與植物單寧減少了瘤胃原蟲數量有關。諸多學者對植物單寧影響瘤胃甲烷排放進行的大量的試驗結果存在差異，可能與試驗中使用的單寧種類、結構、相對分子質量及添加量的不同有關?？傮w而言，植物單寧能夠在一定程度上抑制反芻動物瘤胃甲烷排放，是一種非常有潛力的甲烷抑制劑，但是其抑制瘤胃甲烷生成的作用機理與途徑還亟待進一步深入挖掘。

5 小 結

綜上所述，微生物降解植物單寧具有毒副作用小、殘留量低等優點。隨著合成生物學、基因工程、酶的定向突變技術等新型生物技術的興起，未來利用微生物完成大分子植物單寧的生物降解，將成為植物單寧降解的主流途徑。同時，隨著飼料端“禁抗”的提出以及對植物單寧研究的不斷深入，植物單寧作為一種潛在的新型“替抗”飼料添加劑在畜牧生產中的應用前景將十分廣闊。但是，植物單寧調控瘤胃微生物區系與瘤胃發酵等瘤胃活動的具體作用機制尚不明確，在許多不同的試驗研究中，由于植物單寧的結構、純度、種類和添加量的不同，往往會呈現出不同的效果，當然，這也可能與試驗動物的種類和飼養方式等有關。因此，今后應深入挖掘植物單寧作為瘤胃調控劑、甲烷抑制劑和飼料添加劑等的作用機制，使其更大程度的促進動物生產。