肉桂游離酚提取物改善非酒精性肝細胞脂肪變性的活性研究

李會鵬　龐道?！幀帯⌒蠔|旭　鐘賽意　黎爾納　廖森泰　鄒宇曉

摘要：【目的】分析云野肉桂中不同存在形式酚類物質的含量，并探究其不同存在形式酚類提取物對非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的影響，為熱帶亞熱帶植物肉桂資源的深加工及相關功能性食品的開發和利用提供理論依據?！痉椒ā坑酶Ａ址臃芭饸浠c—四氯對苯醌法分析肉桂中不同存在形式的酚類物質及黃酮類物質的含量;體外以游離脂肪酸誘導劑（油酸鈉∶棕櫚酸=2∶1）誘導HepG2細胞為模型，分析不同濃度的肉桂游離酚/結合酚提取物對NAFLD細胞模型脂滴形成及甘油三酯（TG）含量的影響;體內以高脂飲食結合鏈脲佐菌素誘導的NAFLD小鼠為模型，探究體外篩選的強活性酚類提取物對小鼠血脂及肝臟中TG和游離脂肪酸含量的影響?！窘Y果】肉桂多酚主要以游離酚（55.99±0.45 mg GAE/g）的形式存在，含有一定比例的結合酚（3.21±0.12 mg GAE/g），其中黃酮類物質（46.49±4.75 mg CE/g）是肉桂的主要酚類物質之一。云野肉桂游離酚提取物可有效降低NAFLD細胞模型胞內TG的水平。與模型組相比，經中和高劑量的肉桂游離酚提取物作用后，細胞內TG含量顯著降低（P<0.05，下同），分別降低17.07%和26.83%，而結合酚提取物作用后細胞內TG水平與模型組相比無顯著差異（P>0.05）。動物試驗結果表明，高劑量的游離酚提取物干預后，不僅可以顯著降低小鼠血清中TG、膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，還能顯著降低小鼠肝臟中TG和游離脂肪酸含量，分別降低42.21%和22.22%。液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）分析結果表明，肉桂游離酚提取物主要由原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1等物質組成?！窘Y論】肉桂游離酚提取物對NAFLD可能具有較好的改善作用，且原花青素類物質可能是發揮改善肝細胞脂肪變性作用的主要物質基礎。

關鍵詞： 肉桂提取物;多酚;脂肪變性;NAFLD細胞模型;小鼠

中圖分類號： S567.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0879-12

Effects of Cinnamon cassia free phenolic extract on nonalcoholic hepatocyte steatosis

LI Hui-peng PANG Dao-rui LIU Yao-yao XING Dong-xu

ZHONG Sai-yi LI Er-na LIAO Sen-tai ZOU Yu-xiao

（1College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong? 524088， China; 2Sericultural & Agri-Food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory

of Functional Food， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing/Maoming Branch， Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture， Guangzhou，

Guangdong? 510610， China）

Abstract：【Objective】The contents of different forms of phenols of Cinnamon cassia and the effects of different forms of phenolic extracts on non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD） were studied in order to provide a theoretical basis for the processing of cinnamon resources and the development of functional foods of cinnamon. 【Method】The contents of phenols and flavonoids in cinnamon were analyzed by the Folin phenol method and the sodium borohydride/chloranil based assay（SBC），respectively. HepG2 cells induced by sodium oleate and palmitic acid （2∶1） were used as an in vitro model to analyze the regulation effects of different concentrations of free or bound phenolic extracts of C. cassia on the formation of intracellular lipid droplets. The change of triglyceride（TG） content of different groups was also determined. Compared with the bound phenolic extract，the free polyphenol extract of cinnamon showed a better effect on steatosis. Furthermore，mice fed on a high sugar and high fat diet in combination with streptozotocin（STZ） was used as to model the in vivo effects of the phenolic extracts on serum and liver lipids. 【Result】The results suggested that polyphenols（55.99±0.45 mg GAE/g） existed in cinnamon extracts mainly in free form. Notably，some bound polyphenols（3.21±0.12 mg GAE/g） were also detected. The flavonoids（46.49±4.75 mg CE/g） were the main component of cinnamon polyphenols. The free phenolic extract of the Yunye cultivar of cinnamon can effectively reduce the TG level in vitro. The extracts of medium and high dose groups significantly decreased the TG level by 17.07% and 26.83% relative to that of the model group，respectively（P<0.05，the same below）. There was no significant difference in intracellular TG level between the model group and the bound phenol extract group（P>0.05）. The results of animal experiments showed that the contents of TG，total cholesterol（TC） and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） in the serum of mice decreased significantly after the intervention of high dose free phenol extract. High dose cinnamon free phenol extract also significantly reduced the contents of TG and FFA in the liver of mice，which decreased by 42.21% and 22.22%，respectively. The results of LC-MS/MS showed that procyanidins C1，B2，A2，B3 and B1 may be the main flavonoid compounds of the cinnamon free phenolic extract. 【Conclusion】These results reveal that cinnamon free phenolic extract may have a good effect on NAFLD，and procyanidins may be the main compounds effective against the steatosis of liver cells.

Key words： cinnamon extract; polyphenols; hepatocyte steatosis; cell model of NAFLD; mice

Foundation items： Guangdong Key Field Research and Development Plan Project （2020B020225005）; Innovative Research Team Construction Project for Modern Agricultural Industry Common Key Technologies of Guangdong （2020KJ117）; Emerging Discipline Team Construction Project of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202119TD）; Independent Research and Development Projects of Maoming Laboratory（2021ZZ004）

0 引言

【研究意義】非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的肝損傷因素所致的肝細胞內脂肪沉積的臨床病理綜合癥（中華醫學會內分泌學分會，2018）。NAFLD在我國的患病率高達25%，已成為我國第一大慢性肝病且患病年齡逐漸趨于年輕化（Do and Lim，2016）。由于相關西藥的副作用較多，植物中具有降脂活性的天然產物逐漸受到人們的關注。肉桂是樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥樹皮（侯小濤等，2018），是我國衛生健康委員會認定的藥食兩用植物資源。肉桂原產于斯里蘭卡，在我國主要分布于廣西、廣東、福建、臺灣等南方地區。我國雖然是世界上肉桂最大的出口國，但多局限于肉桂皮原料和肉桂油粗品的直接出口，不僅缺乏深加工，還造成優質資源的嚴重浪費。肉桂多酚具有抗氧化（Qin et al.，2014）、調節糖脂代謝（姜瓊等，2013;Afrose et al.，2019）的生物活性，且多酚的存在形式可能會影響其生物活性。因此，探究肉桂不同存在形式的酚類提取物對肝細胞脂肪變性的影響，對其資源的開發和高效利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】NAFLD一般通過管理生活方式、手術治療及服用藥物等方式緩解。研究者主要從胰島素抵抗、肝細胞凋亡和炎癥反應等關鍵環節進行藥物開發（遲驍瑋，2021）。但有些藥物具有明顯的副作用，如引發腹脹和便秘等不良癥狀（陶琦等，2021）。肉桂中已鑒定出的多酚主要為類黃酮類及其多聚體化合物，包括兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、原花青素類、縮合單寧和阿魏酸等（胡少平，2014）?，F國內外對肉桂的研究主要集中在肉桂提取物的藥理作用上，且取得了一定的成果。Shafiee-Nick等（2012）發現含有肉桂皮的中草藥混合物可改善糖尿病大鼠高血糖癥，降低血脂和天門冬氨酸氨基轉移酶的活性。Lopes等（2015）探討了長期補充肉桂水提物對小鼠脂質代謝的影響，發現肉桂水提物可減少小鼠體重和脂肪儲存量，有助于預防或延緩脂質紊亂。Tulini等（2016）將富含原花青素的肉桂提取物包埋到固體脂質微粒中，改善了其穩定性差、味道不好等缺點，有望擴大其在食品領域中的應用。鐘益寧等（2020）采用濕法制粒技術，研制了能發揮降糖作用的肉桂降糖口含片。目前，含肉桂多酚的功能性食品開發正處于起步階段，其市場具有廣闊的前景?！颈狙芯壳腥朦c】天然產物來源豐富且安全性相對較高，部分天然活性物質表現出降脂效果，因此從天然產物中尋找降脂活性成分是目前的前沿研究領域之一。然而，前人對肉桂酚類物質的分析多以游離態多酚含量作為總多酚，往往忽視對不同存在形式酚類物質的分析。此外，肉桂不同存在形式的酚類物質調節肝細胞脂質代謝的研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】以華南地區較為廣泛種植的云野肉桂為原料，分析其不同存在形式的多酚和黃酮含量，并探究游離態和結合態多酚提取物對NAFLD細胞模型脂肪變性的影響，篩選出較強活性的酚類提取物在體內試驗中進行驗證，為肉桂資源的開發和深入利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

云野肉桂由廣西林業科學院經濟林研究所提供，50 ℃烘干后，粉碎過40目篩保存。軟脂酸、油酸鈉、洛伐他汀和鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自上海凜恩科技發展有限公司;HepG2細胞購自中國科學院上海細胞庫;油紅O染色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司;甘油三脂（Triglyceride，TG）、膽固醇（Total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（Free fatty acids，FFA）和總蛋白定量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;蘇木素伊紅染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司;氫氧化鈉、無水碳酸鈉和二甲苯等均為分析純。

主要儀器設備：UV-1800型紫外—可見分光光度計（日本島津有限公司）;RW 20 digital均質機（廣州市深華生物技術有限公司）;N-1300型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）;LDZX-50L型高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）;SW-CJ-1FD型細胞超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）;THERMO FORMA 370細胞培養箱（美國Thermo Scientific公司）;DMI 4000B光學顯微鏡（德國Leica微系統有限公司）;SYNERGY H1全功能酶標儀（美國Biotek公司）;YD-AB攤片烤片一體機（金華市益迪醫療設備有限公司）;HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）;SCIEX Q-Trap 6500+（美國SCIEX公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 肉桂游離酚提取物制備 肉桂游離酚提取物的制備參考Pang等（2017）的方法，并稍作改動。稱取肉桂粉10 g，按料液比1∶30（w/v）加入70%乙醇，70 KHz下超聲提取0.5 h，4 ℃下離心（4500 r/min，10 min）;收集上清液，殘渣重復提取2次，合并上清液;45 ℃旋轉蒸發并定容至25.0 mL，貯存于冰箱備用。

1. 2. 2 肉桂結合酚提取物制備 肉桂結合酚提取物的制備參考Adom和Liu（2002）的方法。向1.2.1得到的肉桂殘渣中加入4 mol/L NaOH溶液15.0 mL，消化振蕩90 min，然后用鹽酸調pH至2.0，并用適量的乙酸乙酯萃取5次;將萃取液合并，45 ℃旋轉蒸發至干，定容至10.0 mL后，貯存于冰箱備用。

1. 2. 3 肉桂游離酚/結合酚提取物中酚類物質含量測定 酚類物質含量采用福林酚法（謝利華，2018）進行測定，以沒食子酸為標準品。吸取0.5 mL肉桂游離酚/結合酚提取物稀釋液，加入2.0 mL去離子水和0.5 mL福林酚試劑后，混勻靜置;再加入5.0 mL 7%碳酸鈉溶液和4.0 mL去離子水，混勻，室溫放置90 min，測定OD。酚類物質含量以mg沒食子酸（GAE）/g表示，以干重計。

1. 2. 4 肉桂游離酚/結合酚提取物中黃酮類物質含量測定 黃酮類物質含量采用硼氫化鈉—四氯對苯醌法（龐道睿，2018）進行測定，以兒茶素為標準品。取1.0 mL樣品稀釋液，氮氣吹干后用乙醇—四氫呋喃（1∶1，v/v）復溶;分別加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液和0.5 mL 74.6 mmol/L AlCl3溶液，室溫反應30 min，再加入0.5 mL 50 mmol/L NaBH4溶液，室溫反應30 min;加入2.0 mL 8 mmol/L冰醋酸溶液，避光且室溫反應15 min;加入1.0 mL 20 mmol/L四氯對醌溶液，油浴1 h，冷卻后用甲醇定容至4.0 mL，再分別加入1.0 mL 16%香草醛甲醇溶液和2.0 mL濃鹽酸，混勻后暗反應15 min，離心，取上清液測OD。其含量以mg兒茶素（CE）/g表示，以干重計。

1. 2. 5 NAFLD細胞模型建立 NAFLD細胞模型的建立參考殷錦錦等（2014）的方法，稍作改動。采用油酸鈉和棕櫚酸（2∶1）誘導建立NAFLD細胞模型。將HepG2細胞以每孔4×10接種于96孔板中，進行24 h貼壁培養，然后更換含有0.4 mmol/L FFA誘導劑的DMEM培養基，誘導造模24 h。

1. 2. 6 肉桂游離酚/結合酚提取物對NAFLD細胞模型的影響 先通過CCK-8試劑盒測定肉桂游離酚/結合酚提取物對細胞存活率的影響，確定本研究使用樣品的濃度。將HepG2細胞以每孔4×104接種于96孔板中，在培養箱中培養24 h，更換含有不同濃度肉桂酚類提取物和0.4 mmol/L FFA誘導劑的DMEM培養基，作用24 h，PBS清洗3次。具體分組如下：空白組：含1% BSA的DMEM培養基培養;模型組：含0.4 mmol/L FFA的DMEM培養基培養;陽性對照組：含5 μmol/L洛伐他汀和0.4 mmol/L FFA誘導劑DMEM培養基培養;試驗組：含有不同濃度肉桂游離酚提取物（0.08、0.16、0.32 mg/mL）或肉桂結合酚提取物（1.5、3.0、6.0 mg/mL）和0.4 mmol/L FFA的DMEM培養基培養。油紅O染色后用顯微鏡觀察細胞內紅色脂滴的形成情況，并測定細胞中TG含量。

1. 2. 7 NAFLD小鼠模型建立 試驗動物采用SPF級BALB/c小鼠（4周齡，雄性，體重18～22 g），購自南方醫科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（粵）2016-0041。采用高脂飼料結合STZ造模。模型組飼喂高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，TP23520）滿2周后，注射100 mg/（kg·bw）STZ輔助造模，并繼續飼喂4周。眼眶采血檢測各組小鼠血清TG和TC含量，若與正常組相比，模型組二者含量顯著升高（P<0.05，下同），則模型建立成功（李思錦等，2022）。試驗期間所有操作均嚴格按照中國實驗動物的相關飼養規范和法律規定進行。

1. 2. 8 肉桂游離酚提取物對NAFLD小鼠的降脂活性評價 在進行動物試驗之前，按1.2.1的提取方法制備灌胃所需的肉桂游離酚提取物。將肉桂游離酚提取物上清液離心、濃縮、真空冷凍干燥后，保存于-20 ℃冰箱備用。小鼠的灌胃劑量根據體表面積使用以下公式計算（閆俐維等，2021）：

小鼠的劑量（mg/kg）=人的劑量（mg/kg）×12.33

結合Gruenwald等（2010）、Taheri等（2018）的研究結果，進一步設置本研究肉桂游離酚提取物的灌胃劑量分別為1、4和8 g/（kg·bw），以鮮重計。

造模成功后，進一步研究肉桂游離酚提取物對小鼠的降脂活性。按每組6只進行分組（表1）。肉桂游離酚提取物灌胃干預4周后，禁食12 h，麻醉后取血，按照試劑盒的方法檢測小鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。解剖取肝臟，用于分析肝臟指標。取100 mg肝臟組織用甲醇∶氯仿（1∶2，v/v）溶液進行勻漿，振蕩提取60 min并用氮氣吹干，再用適量的異丙醇重新溶解（Wang et al.，2014）。離心取上清液，用于小鼠肝臟TG和FFA含量的測定。

1. 2. 9 肉桂游離酚提取物組成成分分析 采用液相色譜串聯質譜（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法檢測肉桂游離酚提取物的化學組成成分。稱取50 mg肉桂游離酚提取物凍干粉，溶解于500 μL提取液中。離心（12000 r/min，10 min），取上清液，重復提取1次;上清液過濾膜后，保存于進樣瓶中。

液相條件：色譜柱為ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL;流動相：A為甲醇，B為超純水（加入0.1%甲酸）;梯度洗脫：A溶劑的程序為0～6 min：95%～50%，7～12 min：50%～5%，12～14 min：5%～5%，14～16 min：5%～95%，二極管陣列紫外檢測器全波長掃描，紫外檢測器流出液不經分流直接導入質譜系統檢測。

質譜條件：采用ESI源，正離子模式下質譜電壓5500 V，離子掃描范圍100～800 m/z，溫度550 ℃，氣簾氣35 psi。

1. 2. 10 肝臟組織病理學檢測 小鼠肝臟經4%甲醛固定后，用梯度酒精進行脫水，然后石蠟包埋切片。HE染色后，參照姚笑睿（2017）的方法對切片進行組織病理學分析。

1. 3 統計分析

數據結果均以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 24.0進行方差分析（ANOVA），Duncan’s多重比較方法進行顯著性方差分析，以GraphPad Prism 9.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 肉桂酚類提取物中多酚和黃酮含量分析結果

云野肉桂酚類提取物中多酚和黃酮含量測定結果如圖1所示。由圖1-A可知，云野肉桂游離酚含量（55.99±0.45 mg GAE/g）顯著高于結合酚含量（P<0.05，下同），而與總酚含量（59.20±0.28 mg GAE/g）之間無顯著差異（P>0.05，下同）。因此，肉桂多酚主要以游離酚的形式存在。由圖1-B可知，游離黃酮含量（42.57±3.20 mg CE/g）顯著高于結合黃酮含量，而與總黃酮含量（46.49±4.75 mg CE/g）之間無顯著差異。參考Wang等（2013）的方法，基于酚類物質標準品沒食子酸和黃酮類物質標準品兒茶素的摩爾質量，計算出游離黃酮對游離酚的貢獻率為44.86%，總黃酮對總酚的貢獻率為46.50%。由此可知，肉桂黃酮主要以游離黃酮的形式存在，黃酮類物質是肉桂的主要酚類物質之一。

2. 2 肉桂酚類提取物對NAFLD細胞模型的影響

2. 2. 1 游離酚提取物對NAFLD細胞模型的影響

通過CCK-8試劑盒測定肉桂游離酚提取物對細胞存活率的影響，當提取物濃度為0.04～0.32 mg/mL時，對細胞無明顯毒性作用。因此，選擇濃度小于0.32 mg/mL提取物開展后續試驗。油紅O染色結果如圖2所示，與空白組相比，模型組內紅色脂滴積聚明顯，由此可知積累了大量的脂質;而不同濃度的肉桂游離酚提取物作用后，一定程度減少了細胞內的紅色脂滴含量。

肉桂游離酚提取物作用后細胞內TG含量如圖3所示。與空白組比較，模型組細胞內的TG含量顯著升高;與模型組相比，肉桂游離酚提取物低劑量組TG含量降低3.66%，但差異不顯著，中劑量組TG含量顯著降低17.07%，高劑量組TG含量顯著降低26.83%，但高劑量組TG含量與空白組間差異不顯著。

2. 2. 2 結合酚提取物對NAFLD細胞模型的影響

通過CCK-8試劑盒測定肉桂結合酚提取物對細胞存活率的影響，當提取物濃度為0.78～6.25 mg/mL時，對細胞無明顯毒性作用。因此，選擇濃度小于6.25 mg/mL肉桂結合酚提取物開展后續試驗。油紅O染色結果如圖4所示，空白組視野內有少量的紅色脂滴，而模型組積累了大量的脂質且積聚明顯;肉桂結合酚提取物作用后，細胞內的紅色脂滴未得到明顯改善，仍然積聚明顯。

肉桂結合酚提取物作用后細胞內TG含量如圖5所示。與空白組比較，模型組細胞內的TG含量顯著升高;經肉桂結合酚提取物低、中和高劑量作用后，與模型組相比，細胞內的TG含量差異不顯著。以上結果表明，結合酚提取物處理后，未顯著降低HepG2細胞內的TG含量。

2. 3 NAFLD小鼠模型的建立

造模成功后，模型組小鼠（圖6-B）與正常組小鼠（圖6-A）相比，毛發雜亂，且攝食、飲水和排泄量明顯增加。與正常組小鼠體重（27.72±0.75 g）相比，模型組小鼠體重明顯增加，為31.03±1.55 g;模型組小鼠肝臟的重量為2.18±0.42 g，與正常組小鼠（1.33±0.20 g）相比，也有明顯增加。肝臟組織病理學檢測結果表明，與正常組小鼠（圖6-C）相比，模型組小鼠（圖6-D）肝細胞排列紊亂，發生了嚴重的脂肪樣變性和空泡變性。表明NAFLD小鼠模型建立成功。

2. 4 肉桂游離酚提取物對小鼠血脂水平的影響

基于體外試驗結果，分析肉桂游離酚提取物對模型小鼠血脂的影響（表2）。經游離酚提取物干預后，小鼠血清中TG含量與模型組相比顯著降低;分析各組小鼠TC含量發現，經中劑量和高劑量的游離酚提取物灌胃干預后，小鼠血清中TC含量較模型組小鼠分別顯著降低10.39%和25.96%;與模型組小鼠相比，低劑量組小鼠血清中LDL-C含量無顯著差異，而中劑量組和高劑量組血清中LDL-C含量顯著降低;游離酚提取物干預后，小鼠血清中HDL-C含量升高，但與模型組相比差異不顯著。因此，肉桂游離酚提取物可降低模型小鼠的TG、TC和LDL-C含量，提高HDL-C含量。

2. 5 肝臟組織病理學檢測結果

肝臟組織病理學檢測結果如圖7所示。正常組小鼠肝細胞大小一致、排列均勻，肝索排列清晰（圖7-A）;模型組小鼠肝細胞腫脹，發生嚴重的脂肪樣變性和空泡變性，排列不規則，肝索雜亂（圖7-B）;陽性藥物組小鼠肝細胞排列較緊密，空泡變性程度得到改善（圖7-C）。經不同濃度的肉桂游離酚提取物作用后，肝細胞變性程度也得到不同程度緩解;肉桂游離酚提取物低劑量組小鼠肝細胞排列不規則，細胞發生嚴重的炎性細胞浸潤，且空泡變性的現象較多（圖7-D）;中劑量組小鼠肝細胞大小基本一致，排列較規則，部分區域仍存在空泡變性現象（圖7-E）;高劑量組小鼠肝細胞排列較整齊，炎性細胞的浸潤程度降低，空泡變性細胞明顯減少（圖7-F）。因此，肉桂游離酚提取物可能對小鼠脂肪肝有明顯的緩解作用。

2. 6 肉桂游離酚提取物對小鼠肝臟脂代謝的影響

由圖8-A可知，與空白組小鼠肝臟TG含量（1.54±0.35 mmol/gprot）相比，模型組小鼠的含量（3.08±0.64 mmol/gprot）顯著升高，陽性對照組小鼠肝臟中TG含量與空白組差異不顯著;不同劑量的肉桂游離酚提取物灌胃干預后，各劑量組小鼠肝臟中TG含量均顯著低于模型組小鼠肝臟TG含量。低劑量組小鼠肝臟TG含量為2.03±0.22 mmol/gprot，與模型組小鼠相比降低34.09%;中劑量組和高劑量組小鼠肝臟TG含量分別為2.00±0.09和1.78±0.54 mmol/gprot，較模型組小鼠分別降低35.06%和42.21%。由圖8-B可知，模型組小鼠肝臟FFA含量（0.45±0.05 mmol/gprot）顯著高于空白組小鼠，是正常組小鼠肝臟FFA含量的1.36倍;經不同劑量的肉桂游離酚提取物灌胃干預后，各劑量組小鼠肝臟中FFA含量表現出不同程度的降低。其中，中劑量組和高劑量組肝臟中FFA含量與模型組相比，分別顯著降低17.78%和22.22%。

2. 7 肉桂游離酚提取物成分分析結果

肉桂游離酚提取物經LC-MS/MS分析后，共鑒定出28種化合物，主要由原花青素類和糖苷類物質組成（表3）。原花青素主要包括原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1，其中，原花青素C1含量最高（5384.02±818.06 μg/g），原花青素B2含量（3110.15±474.26 μg/g）次之，原花青素B1含量在原花青素類中最少，為120.24±22.32 μg/g。此外，糖苷類物質種類豐富，含量介于0.02±0.00～7.45±1.00 μg/g。具體物質的定性和定量分析見表3。

3 討論

肉桂含有豐富的多酚類物質，其總酚含量為59.20±0.28 mg GAE/g，明顯高于富含多酚的常規水果（Sun et al.，2002）。植物多酚主要以游離態和結合態的形式存在。游離酚易于提取，可在人體內消化吸收;而結合酚通常以共價鍵形式（酯鍵、醚鍵和碳—碳鍵）結合在植物細胞壁結構物質上（張浩，2021），其可在胃腸道內因酶水解而釋放，經機體吸收和代謝發揮健康益處。有研究表明結合酚經機體腸道菌群發酵后可能比游離酚具有更強的生物活性（Acosta-Estrada et al.，2014）。若只對游離酚進行研究而忽略結合態多酚的存在，會低估植物原料中多酚化合物的營養健康效應。本研究通過堿水解方式，破壞相關的共價鍵來提取肉桂中的結合酚，結果表明，肉桂多酚主要以游離酚的形式存在，也存在一定比例的結合酚（3.21±0.12 mg GAE/g）。此外，本研究中檢測到肉桂中總黃酮含量為46.49±4.75 mg CE/g，與前人研究結果（林款等，2019）存在一定差異，可能與檢測方法有一定關系，本研究中所用的SBC法可檢測包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷醇和花青素等更多的黃酮類物質，故本研究的測定結果可能較前人測定結果更準確。

大量研究證實多酚是重要的活性成分，可能具有調節脂代謝的作用（Park et al.，2013;Rafiei et al.，2018）。為探究肉桂酚類提取物對肝臟脂肪變性的調節作用，本研究在體外建立NAFLD細胞模型分析肉桂酚類提取物改善NAFLD的活性。國內外的研究表明，可利用游離脂肪酸誘導HepG2細胞脂肪變性構建體外模型。張玉龍（2021）、Hsu等（2021）分別以0.5 mmol/L油酸或0.3 mmol/L棕櫚酸誘導HepG2細胞建立NAFLD模型，研究鴨油和黃瓜多酚水提物對脂質代謝的影響。然而，飽和脂肪酸（棕櫚酸）和不飽和脂肪酸（油酸）均是人們日常飲食中攝入的常見長鏈脂肪酸。由于攝入飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的過量或失衡會導致NAFLD的發生，且劉萌等（2016）研究發現油酸和棕櫚酸（2∶1）對HepG2細胞毒性較小，誘導后更符合人體脂肪變性的病理過程，因此，本研究利用0.4 mmol/L FAA誘導劑（油酸鈉∶棕櫚酸=2∶1）造模，并運用此模型進行肉桂酚類提取物改善脂質代謝的研究。

肉桂游離酚提取物中含有多種形式的原花青素類和糖苷類物質，還有少量的蘆丁等物質存在。目前，已有研究證明上述化合物具有調節脂質代謝的作用（Tie et al.，2020;Qin et al.，2021）。原花青素對脂肪酶具有明顯的抑制作用，且聚合度越高，抑制作用越強（周培羽等，2019）;其可能通過調節Wnt3a/β-catenin信號通路，顯著降低體內白色脂肪含量，抑制脂肪沉積（顧艾鑫等，2021）。原花青素B2可能通過調節腸道菌群結構以及脂肪酸代謝、膽汁酸代謝等多個代謝途徑，顯著改善高血脂模型小鼠的血脂代謝異常和氧化應激（吳其國，2019）。此外，異槲皮苷可改善NAFLD大鼠模型肝臟或肝細胞脂質積聚，減輕炎癥和氧化應激（Qin et al.，2018）。蘆丁可減少3T3-L1前脂肪細胞中脂滴的生成，改善細胞內脂質堆積（徐紅敏和吳惠文，2021），還可降低T2DM大鼠的血糖和血脂，改善其糖脂代謝紊亂（苗建紅等，2014）。因此，肉桂中存在的多種黃酮類物質可能對機體脂代謝有明顯的調節作用。經定性和定量分析后，發現肉桂游離酚提取物中含有的原花青素C1、原花青素B2、原花青素A2、原花青素B3和原花青素B1均明顯高于其余23種黃酮類化合物。因此，原花青素類物質可能是改善肝臟細胞脂肪變性的主要物質基礎。本研究中結合酚并未表現出較強的生物活性，推測可能是與該存在形式多酚物質的含量較低有關。

已有研究證明油脂是脂肪肝的重要危險因素，攝入過多的油脂能促進脂肪肝的發生和發展（魏穎等，2014）。TG是FFA和甘油形成的脂肪分子，在體內含量最高;TG合成所需的FFA主要來源于血清和糖代謝（廖海林和肖新華，2014）。高脂飼料中的油脂經機體吸收后，會升高血清中的FFA和TC含量。這為小鼠肝臟的TG合成和TC積累提供了大量原料。本研究結果表明，中劑量和高劑量的肉桂游離酚提取物干預后，肝臟的TG和FFA含量顯著降低。這可能與肉桂游離酚提取物抑制腸道油脂的吸收轉化，降低血清和肝臟中FFA含量，從而降低肝臟合成TG有關。此外，HDL可將TC從肝外細胞轉運至肝臟，將其轉化生成膽汁酸鹽排出體外（王麗霞等，2013）。本研究中肉桂游離酚提取物干預后，血清中HDL-C含量升高。因此，肉桂游離酚提取物還可能通過加快TC的逆轉運，降低血清中TC。但是其調節NAFLD小鼠脂代謝紊亂的信號傳導機制仍需進一步研究。

4 結論

肉桂多酚主要以游離酚的形式存在，也存在一定比例的結合酚，且黃酮類物質是肉桂的主要酚類物質之一。肉桂游離酚提取物在體外具有改善NAFLD細胞模型脂肪變性的作用，而結合酚提取物的作用不明顯。肉桂游離酚提取物不僅可以降低血脂水平，還能降低肝臟中TG和FFA含量，減少肝臟中脂質堆積，減輕肝細胞變性程度。因此，肉桂游離酚提取物對機體的肝臟脂肪變性可能起到改善作用，且原花青素類物質可能是改善肝臟細胞脂肪變性的主要活性物質。

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（責任編輯 羅 麗）