基于科研項目驅動型的本科導師制探索與實踐

李俊輝，梁柳紅，莫楚楚，趙子涵

（廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江）

《國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）》指出：牢固確立人才培養在高校工作中的中心地位，著力培養 品學兼優、本領過硬的高素質專門人才和拔尖創新人才。高等教育承擔著培養高級專門人才、發展科學技術文化、促進現代化建設的重大任務。高校越來越重視創新創業教育與專業學科的融合。結合科研項目，實施科教融合，將教學與科研實踐有效結合起來培養本科生的創新創業能力是高校完善和提高教育教學水平的根本途徑之一。本科生導師制是一種源于牛津大學并流傳至今的人才培養模式，牛津大學針對本科生實施導師制的培養模式，鼓勵學生在與導師面對面的交流討論中不斷激發科研創新能力。廣東海洋大學水產學科是廣東省高水平建設學科。自從2013年以來，大一新生入學后開始本科生導師的培養模式，由學生和導師進行雙向選擇，學生自愿報名，導師可以選擇有意向報名學生。在雙向選擇后，導師為本科生講解實驗，并結合科研項目設立實驗，指導本科生參與實驗。本論文中大學生在導師指導下完成了“大珠母貝類胡蘿卜素代謝相關基因PmApoL序列與表達模式分析”課題，這個完成實驗與論文撰寫過程中，學生的主動探索與導師的悉心指導，提高了本科生創新思維與能力。

一 材料與方法

實驗用貝取自湛江市徐聞縣承梧村海區，挑選無病害的2齡大珠母貝，剪取閉殼?。ˋ）、鰓（Gi）、外套膜邊緣區（Me）、套膜區（Mp）、中央區（Mc）、足（F）和肝胰腺（He），所取組織放入液氮速凍，存于-80℃超低溫冰箱，用于熒光定量分析。

利用試劑盒提取總RNA，通過反轉錄試劑盒將提取RNA反轉錄成cDNA, 實驗步驟及條件均參照說明書進行。

通過分析大珠母貝轉錄組數據庫，篩選與PmApoL基因相似度較高的unigene片段，利用軟件Primer Premier 5.0設計中間片段，5′RACE和3′RACE所需要的基因特異性引物（表1）。

表1 基因克隆及熒光定量的引物序列

利用特異性引物PmApoL-F/PmApoL-R進行基因中間片段擴增，反應體系如下：Premix Taq 5 μL，模板cDNA0.4 μL，滅菌 ddH2O 3.8 μL。將反應程序設定為94℃預變性5min；94℃變性 30 s，61℃退火30 s，72℃延伸2min，35個循環；72℃終延伸10min；4℃保存。將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，證實為目的條帶后連接至pMD18-T載體，并轉化至感受態細胞，菌液培養1h后，涂布于含氨芐青霉素固體平板并倒置37℃培養10h，挑取陽性單克隆進行菌落PCR檢測，將目的基因送至上海生物公司測序。

采用巢式PCR方法對PmApoL基因3′端和5′端進行RACE擴增。3′末端的擴增體系為10 μL：cDNA模板0.4 μL，PmApoL基因-3′-outer 0.4μL，UPM 0.4 μL，Premix Taq5μL，滅菌ddH2O 3.8μL。將退火溫度改為58℃，其他反應程序同上。將第一輪得出的PCR產物用做第二輪PCR反應的模板，引物使用PmApoL-3′-inner，UPM換為NUP，其他反映程序不變。5′末端的擴增反應時，將引物換成對應的5′-outer和5′-inner，反應條不變。其余操作步驟同上。

利用 DNAMAN 軟件的Sequence Assembly程序分別將PmApoL的中間片斷與3′和5′端片段拼接起來，得到PmApoL的基因全長，共1857 bp。再用其Phylogenetic tree程序將大珠母貝PmApoL與其他物種PmApoL構建系統進化樹，利用在線工具 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi ）對PmApoL基因進行開放閱讀框（ORF）和蛋白序列的預測。使用NCBI (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線工具，將所得序列應用BLAST程序進行序列同源性比對和相似性分析，利用ClusterW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/clustalw2_phylogeny/）將大珠母貝PmApoL序列與其他物種序列進行同源性比對。使用SMART PRITION（http://smart.emblheidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1）程序獲得PmApoL的結構域，即基因類型。通過使用通過ExPASy（http://web.expasy.org/vg/index/protein）對氨基酸序列的理化性質進行分析，運用SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal/)在線工具進行信號肽預測；用Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）搜索工具對PmApoL序列進行功能位點檢測，用TMHMM Server v.2.0預測PmApoL的跨膜結構域，用SWISS-MODEL （http://swissmodel.expasy.org/）進行PmApoL的三級結構預測[1]。

通過實時熒光定量 PCR的方法探究大珠母貝不同組織中的表達差異進行分析，以GAPDH為內參。通過2-ΔΔCT計算法得出PmApoL在大珠母貝鰓、中央膜、閉殼肌、肝胰腺的相對表達量。用SPSS 19.0 軟件進行顯著性分析。顯著性水平α=0.05。

二 結果與分析

根據大珠母貝RNA-Seq數據庫中PmApoL的unigene序列設計基因特異性引物，利用RACE技術克隆了PmApoL基因的3端和5端序列，與中間片段拼接得到cDNA全長序列。結果顯示，PmApoL序列全長913 bp，其中5′UTR序列長為142 bp；3′UTR序列長為54 bp；開放閱讀框（ORF）長690bp，編碼229個氨基酸。

圖1 PmApoL基因的cDNA 序列及編碼的氨基酸序列

利用ExPASy在線軟件預測得PmApoL基因理論分子質量為24.38ku；等電點為8.88；負電荷殘基26個，正電荷殘基30個。氨基酸含量分析結果顯示，脂溶指數（Aliphatic index）為114.19，不穩定指數 23.87，屬于穩定蛋白；總平均親水性（Grand averageofhydropathy,GRAVY）為 0.173，屬于疏水性蛋白。用 TMHMM2.0預測PmApoL基因有兩個跨膜結構域，分別在42-64和69-91位氨基酸，該分子屬于膜蛋白。PmApoL的二級結構中，α螺旋結構占整體的76.86%，延伸鏈占7.86%，β 轉角結構占4.37%，無規則折疊占10.92%。利用SMART軟件分析，PmApoL基因有1個ApoL家族保守結構域（圖2）。

圖2 PmApoL蛋白質結構

利用MEGA7軟件構建大珠母貝PmApoL基因與其他物種的進化樹，發現與馬氏珠母貝（Pinctada.imbricata）類聚為一個亞支，親緣關系較近。大珠母貝和馬氏珠母貝是兩個近緣物種，PmApoL基因屬于Apolipoprotein。

圖3 鄰接法構建的PmApoL家族系統進化樹

熒光定量PCR技術分析PmApoL基因在閉殼肌、外套膜套膜區、中央區、足和肝胰腺組織的表達模式。結果顯示，PmApoL基因在各個組織中均有表達，在肝胰腺表達量較高，在閉殼肌和足中表達量較低（圖4）。

圖4 基因在大珠母貝的不同組織中的表達量

熒光定量PCR技術分析PmApoL在大珠母貝6月齡幼貝的閉殼肌、外套膜邊緣區、套膜區、中央區和肝胰腺組織的表達模式。結果顯示，四個候選基因在各個組織中均有表達，其中PmApoL在肝胰腺表達量較高，在閉殼肌中表達量較低。

圖5 基因在大珠母貝的不同組織中的表達量

載脂蛋白（ApoL）屬于高密度脂蛋白家族，參與脂類物質的運輸和代謝。類胡蘿卜素作為一種脂溶性色素，其在體內的運輸與代謝過程中依靠脂蛋白。通過分析大珠母貝套膜組織的RNA-Seq數據，篩選金色珍珠質色素沉淀相關基因，成功克隆了PmApoL基因的cDNA全長序列。PmApoL預測到1個載脂蛋白（ApoL）結構域。根據進化樹分析，PmApoL與馬氏珠母貝Pm-ApoL2基因聚在一個亞支，屬于高密度脂蛋白家族[2]。在大珠母貝成貝與稚貝，PmApoL在肝胰腺組織中表達量最高，其次是外套膜，閉殼肌中表達量最低。雷超等人[3]研究發現Pm-ApoL2在馬氏珠母貝的肝胰腺組織表達量最高，且與類胡蘿卜素在肝胰腺組織的含量呈顯著的正相關。膽固醇，類胡蘿卜素等脂類物質在機體內運輸和代謝過程依靠脂蛋白。家蠶血淋巴細胞主要通過高密度脂蛋白運載類胡蘿卜素，其中90%為葉黃素[4]。無脊椎動物中，肝胰腺負責消化和吸收大量機體所需的養分，也是類胡蘿卜素富集和代謝的重要組織[5-6]。PmApoL在肝胰腺組織特異性高表達，在大珠母貝中，推測PmApoL在肝胰腺組織對脂類的吸收和運輸過程起重要作用。

三 結語

實踐表明，自從實施本科導師制以來，學生通過本科生導師制這個平臺，學生提早進入實驗室，在導師指導下完成相關科研研究；在這個過程中，本科生與導師建立緊密的聯系，使得課堂理論知識與科學實踐有機結合，提高使學習的針對性和自主學習能力。更為重要的是通過實施本科生導師制與構建科教融合的培養模式顯著提高了本科生的創新能力，取得了良好育人效果。