CLOCK基因多態性與腦卒中后靜脈血栓形成的關系

王霞 李美 張文奇 (衡水市人民醫院(哈勵遜國際和平醫院) 康復醫學科，河北 衡水 053000)

靜脈血栓形成是導致腦血管狹窄、閉塞和遠端血流減少的主要原因。特別是腦動脈粥樣硬化性狹窄被認為是腦梗死的獨立危險因素，可導致缺血性腦卒中〔1〕。研究表明，缺血性腦卒中的發病率隨著腦動脈內膜中層厚度(IMT)的增加而升高，腦動脈IMT的增加直接反映了動脈粥樣硬化的程度〔2〕。另外，腦動脈粥樣硬化易損斑塊在腦梗死中起著重要作用〔3〕。

近年來，人們的注意力主要集中在晝夜節律鐘的基因上，這是一系列參與維持不同器官系統內部和之間的內部協調基因，以提高生物體的體質，并對周期性環境事件(如晝夜循環)作出最有效的反應〔4〕。晝夜運動時鐘基因(CLOCK)基因是這方面研究的第一批基因之一，它編碼時鐘蛋白，是晝夜系統的調整蛋白〔5〕。晝夜節律是復雜生物學系統，它的改變，如輪班工作、睡眠剝奪、夜間強光照射及衰老的生理過程或時鐘基因的遺傳變異，都與一些生理和病理條件有關。特別是，CLOCK的變異與肥胖、2型糖尿病、睡眠和情緒障礙及不同類型癌癥的風險存在相關〔6〕。目前，CLOCK基因多態性在腦卒中后靜脈血栓形成的相關性尚不清楚。本研究擬篩選腦卒中后靜脈血栓患者外周血中CLOCK基因多態性，研究其與腦卒中后靜脈血栓形成的相關性，為腦卒中后靜脈血栓患者的早期發現和早期治療提供新的生物標志物,探討CLOCK基因多態性對腦卒中后靜脈血栓形成早期診斷、判斷預后的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年1月至2018年7月在衡水市人民醫院診治的腦卒中患者344例為腦卒中組，其中男212例，女132例，年齡57～73〔平均(66.34±2.13)〕歲。根據超聲檢查是否有靜脈血栓，將其分為未伴靜脈血栓組和伴靜脈血栓組。根據斑塊穩定性又分為穩定斑塊組和不穩定斑塊組。靜脈血栓超聲診斷標準：(1)靜脈血管內存在強弱不等的實質性回聲；(2)加壓狀態下靜脈血管難以被壓癟或僅部分被壓癟；(3)多普勒超聲血流顯像不能探及血流或超聲顯示血流充盈缺損；(4)靜脈血管內徑增寬。斑塊的診斷標準包括：①IMT>1.3 mm或比鄰近部位厚0.5 mm，或IMT為鄰近部位的1.5倍；②彩色圖像顯示增厚內膜向血管腔內凸出。根據超聲表現分為扁平斑塊、軟斑塊、硬斑塊和潰瘍斑塊。根據斑塊回聲和回聲水平，扁平斑塊和硬斑塊被認為是穩定的，而軟斑塊、潰瘍斑塊和各種混合斑塊被認為是不穩定的(脆弱的)。本研究以占據動脈管>75%為大型斑塊。腦梗死診斷標準符合2007年《中國腦血管病防治指南》〔7〕。如果受試者患有自身免疫性疾病、全身炎癥性疾病、癌癥、風濕性心臟病、肌肉骨骼疾病、甲狀腺疾病、肝腎功能異常，外傷史，研究期間接受手術則被排除在外。收集同期169例健康志愿者作為對照(正常組)，其中男98例，女71例，年齡50～75〔平均(62.37±3.01)〕歲，兩組對比一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。受試者均給予書面知情同意。

1.2數據收集 所有受試者都有詳細的既往病史、個人史、家族史和缺血性腦卒中史。高血壓診斷為收縮壓>140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓>90 mmHg；空腹血糖>7.0 mmol/L或隨機血糖>11.1 mmol/L伴有典型糖尿病癥狀者診斷為糖尿??；有典型病史或經心電圖、超聲心動圖證實者為冠心病。吸煙者被定義為吸煙累計超過5年或戒煙不超過5年。

1.3血樣采集 抽取受試者4 ml空腹肘靜脈血，用于分離血清。在ADVIA2400全自動生化分析儀上用生化比色法測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和葡萄糖。正常參考值TC<5.2 mmol/L，TG<1.7 mmol/L，葡萄糖<3.96.1 mmol/L。

1.4腦動脈B超檢查 采用美國通用電氣公司的Vivid 7型彩色多普勒超聲診斷儀的10 mHz線探頭，由專業人員對腦動脈進行垂直和水平二維B超掃描。將受試者置于仰臥位，頭部略微向后，以充分暴露腦部的檢查側。獲得了包括IMT在內的技術數據。斑塊形成定義為腦動脈IMT>1.0 mm。質地回聲強于周圍組織，表面光滑的斑塊被定義為硬斑塊，視為穩定斑塊；質地回聲弱于周圍組織，表面回聲低的斑塊被定義為軟斑塊。腦動脈IMT在1.0～1.3 mm為腦動脈粥樣硬化，大于1.3 mm為腦動脈斑塊。

1.5qPCR檢測 使用TRIzol試劑盒從血清中提取總RNA，并使用mRNA分離試劑盒分離mRNA。用反轉錄試劑盒(TaKaRa)轉錄成cDNAs。定量實時聚合酶鏈反應用qRT-PCR試劑盒(TaKaRa)進行。程序設置如下：95℃持續1 min；35個循環，95℃持續15 s，60℃持續15 s，72℃持續30 s；最后95℃、65℃和30℃各持續1 min。采用ABI-PRISM 7900HT RT-PCR系統，進行檢測，用2-ΔΔCt法檢測相關基因表達水平。引物序列:CC正義鏈:5'-TAGATGGTGTCCTCCAAACTGCTT-3'，反義鏈5'-GTTTTTAATAGCTGAGTAGTATTCCATTGT-3'；CG正義鏈：5'-TAGATGGTGTCCTGCAAACTGCTT-3'，反義鏈5'-GTTTTTAATAGCTGAGTAGTATTCCATTGT-3'；GG正義鏈:5'-GTTTTTTGACTTTTAAGAGTCT-3'，反義鏈5'-TCAGTTTATCCATTTGCCCCAAGG-3'。

1.6生存率研究 總生存率為研究終點，為手術至死亡或最近的隨訪時間。每個月通過門診或是電話隨訪患者。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1CLOCK rs4580704 C基因突變成G基因(C>G)基因型在正常組和腦卒中組的差異 正常組CLOCK rs4580704 GG基因型高于腦卒中組，CG低于腦卒中組，差異具有統計學意義(P<0.05)。正常組CLOCK rs4580704 CC及CG+GG比例與腦卒中組比較差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 CLOCK rs4580704 C>G基因型在 正常組和腦卒中組的差異〔n(%)〕

2.2腦卒中組不同基因型一般資料比較 各組的年齡、體重、腰圍、吸煙、體重指數(BMI)、TC、TG、低密度脂蛋白、高血壓、糖尿病和冠心病，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 腦卒中不同基因型組一般情況比較

2.3CLOCK rs4580704不同基因型腦卒中生存率比較 CLOCK rs4580704 CC組的生存率(73.2%)顯著高于CG組(70.1%)，但顯著低于CG+GG組(81.0%)和GG組(90.5%，均P<0.05)。見圖1。

圖1 CLOCK rs4580704不同基因型對腦卒中生存率的影響

2.4CLOCK rs4580704在腦卒伴靜脈血栓患者的相關性 與未伴靜脈血栓組比較，伴靜脈血栓組中CLOCK rs4580704 CC及CG比例顯著上升，CLOCK rs4580704 CG+GG及GG比例顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 腦卒中伴靜脈血栓組與腦卒中組基因型比較〔n(%)〕

2.5CLOCK rs4580704不同基因型對腦卒中伴靜脈血栓患者生存率的影響 腦卒中伴靜脈血栓患者CLOCK rs4580704 CC組生存率(70.24%)顯著高于CG組(68.40%)，顯著低于CG+GG組(77.60%)及GG組(86.18%，P<0.05)。見圖2。

2.6穩定斑塊與不穩定斑塊組CLOCK rs4580704基因型比較 穩定斑塊組與穩定斑塊組比較，不穩定斑塊組中CLOCK rs4580704 CC比例顯著下降，CLOCK rs4580704 CG和CG+GG比例顯著上升(P<0.05)。見表4。

2.7不同斑塊體積CLOCK rs4580704基因型比較 與大型斑塊組比較，小型斑塊組中CLOCK rs4580704 CC和GG比例顯著下降，CLOCK rs4580704CG和CG+GG比例顯著上升(P<0.01)。見表5。

圖2 CLOCKrs4580704不同基因型對腦卒中伴 靜脈血栓患者生存率的影響

表4 穩定斑塊與不穩定斑塊組CLOCK rs4580704 基因型比較〔n(%)〕

表5 不同斑塊體積CLOCK rs4580704基因型比較〔n(%)〕

3 討 論

動脈粥樣硬化是導致腦動脈狹窄或閉塞、缺血性腦卒中的主要原因，在世界范圍內發病率和死亡率都很高〔1,8〕。缺血性腦卒中占所有腦卒中的60%～80%〔9〕。有證據表明，腦動脈IMT和斑塊在很大程度上受基因控制，這兩種基因分別導致30%～60% IMT和約28%的斑塊增加〔10〕。

竇靜脈血栓形成的基礎可能與Virchow的三聯征有關，包括血管壁損傷、高凝狀態和淤滯〔11〕。到目前為止，已知的血栓形成的易感危險因素包括炎癥，而感染除了增加顱內靜脈竇血栓形成(CVST)的風險外，還可能增加患者血栓形成的風險〔12〕。感染期間特異性地導致血栓形成的病理生理機制尚未完全闡明，但炎癥已被視為高凝狀態的原因之一，炎癥在腦卒中中也起著重要作用〔11〕。本研究發現，CLOCK rs4580704 CC可能參與腦卒中疾病的發生發展，但機制尚不明確。

自發性(非創傷性)腦出血引起的腦卒中是由于腦動脈或小動脈破裂后血液外滲到腦實質引起的。全球疾病負擔研究估計，2010年全世界共發生532萬例(首次)出血性腦卒中(即腦出血和蛛網膜下腔出血)，導致每10萬人年發生82例，高血壓是腦出血的最大危險因素，人群歸因風險約為50%〔1,8〕。近幾十年來，腦出血時抗血栓(抗血小板或抗凝劑)藥物的使用率已上升至約50%?；谌巳旱牟±龑φ昭芯繄蟾娣Q，在腦出血患者中，約20%服用抗凝劑，30%在癥狀出現時服用抗血小板藥物，而在無腦出血患者中，約6%服用抗凝劑，約23%服用抗血小板藥物〔13〕。本研究結果顯示，CLOCK rs4580704 CC參與腦卒中患者靜脈血栓的形成。

腦出血的幸存者有復發腦出血的風險，特別是如果不治療腦出血的潛在原因(如高血壓、動靜脈畸形)，同時也有缺血性腦卒中、缺血性心臟病、房顫和全身性栓塞的風險〔14〕。有研究比較了腦出血后腦內不同部位的預后，其中兩項發現大葉性腦出血后復發的風險高于深部腦出血〔12〕。一些患者的磁共振成像(MRI)中發現腦微出血是復發性缺血性腦卒中和腦出血風險較高的生物標志物〔12〕。本研究結果證明，CLOCK rs4580704 CG+GG可能抑制腦卒中患者靜脈血栓的形成。

內源性晝夜節律計時系統包括下丘腦的視交叉上核(SNC)及不同器官的外周周期振蕩。核心分子由一個轉錄-翻譯-反饋環組成，該環以24 h的節律振蕩〔15〕。幾個核心時鐘基因參與了這個系統的調節。其中，晝夜運動輸出周期(Kaput)基因是一種轉錄因子，來自與大腦和肌肉ARNT-Like(BMAL1)形成復合物的分子時鐘。在小鼠模型中，CLOCK突變首先與葡萄糖穩態相關，然后與肥胖、高血糖和高胰島素血癥相關〔16〕。CLOCK rs4580704 C>G是與其他蛋白連鎖，產生調控作用〔16〕。降脂藥物和飲食網絡人群遺傳學的工作中，觀察到攜帶CLOCK rs4580704的次要等位基因(G)的攜帶者具有較低的體重、空腹胰島素和高血糖風險〔17〕。 此外，研究發現，CLOCK rs4580704和單不飽和脂肪酸攝入量之間的基因相互作用，以確定CLOCK的空腹血糖和胰島素抵抗。當不飽和脂肪酸攝入量較低時，這些CLOCK表達沒有差異〔18〕。然而，當不飽和脂肪酸攝入量較高時，少數等位基因攜帶者的血糖水平明顯較低。研究認為，這種CLOCK rs4580704可能與調節胰島素抵抗風險有關〔18〕。Corella等〔19〕研究發現，在2型糖尿病患者中，CLOCK基因變異與2型糖尿病和心血管疾病的發病率相關。本研究發現，CLOCK rs4580704 CG+GG可以減少靜脈血栓斑塊的穩定性。

晝夜節律基因通過轉錄和翻譯反饋環控制mRNA的周期轉錄和蛋白質合成。電壓門控鈉離子通道(SCN)中含有一些必需的蛋白質。激活因子是CLOCK和芳香烴受體核轉運體樣(ARNTL)，而轉錄抑制劑是周期基因(PER)和隱花色素(CRY)蛋白〔18〕。Tracey等〔20〕研究發現，CLOCK基因調控小板生成素與表達。 本研究發現，CLOCK rs4580704 CG+GG可以減少斑塊體積，參與靜脈血栓的形成。

綜上，CLOCK rs4580704 CG+GG可能抑制腦卒中患者靜脈血栓的形成，可能作為臨床治療腦卒中相關神經血栓重要指標，但其作用機制還有待進一步探討。