PD-1和CTLA-4 3′UTR基因交互作用在HBV感染中的作用*

張國妤 齊曉霞 陸宏偉 盧樂

(1.西安交通大學第一附屬醫院感染科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第二附屬醫院普外科，陜西 西安 710004)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是全世界范圍內的嚴重公共衛生問題之一。據 WHO統計，全世界約有20億人曾感染過HBV，而其中超過2.96億是慢性HBV感染者，每年全球大約有82萬人死于HBV感染及其相關疾病[1]。HBV感染機體后，主要是由于細胞免疫對肝細胞的致病作用對機體造成損傷。近年來，與免疫調節呈負性相關的幾個重要的免疫抑制性分子——程序性細胞死亡分子-1(programmed cell death-1, PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)、T 細胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3)由于在慢性感染中發揮著重要作用而倍受關注[2-3]。miRNA 是一類非常重要的轉錄后調控因子，可以通過對靶mRNA 的負性調控作用，影響生物體的生長發育，細胞的凋亡，疾病的發生等。miRNA 與靶mRNA 分子3′非翻譯區(3′untranslated region, 3′UTR)的特異性結合是調控mRNA 水平和蛋白表達的關鍵。miRNA 與靶基因mRNA 的結合效率依賴于mRNA 的序列以及分子內結構。而miRNA 靶基因SNP能夠導致mRNA 側翼區域結構的改變，建立新的miRNA 靶結合位點或去掉原有的靶結合位點，影響miRNA 的結合效率和靶基因的表達[4-5]。因此，miRNA 靶序列SNP 可以通過影響miRNA 與靶mRNA 3′UTR 的結合，參與基因功能的調控。有研究已經報道了PD-1 3′UTR的rs10204525位點和CTLA-4 3′UTR的rs3087243位點在HBV感染中分別發揮著作用[6-7]。因此，我們通過病例對照研究探討慢性HBV感染者PD-1和CTLA-4 3′UTR的基因多態性分布，以及兩者之間的交互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集西安交通大學第一附屬醫院2011年8月～2013年6月慢性HBV感染者433例，其中男328例，女105例，平均年齡(39.33±13.20)歲。所有病例的診斷均符合2019年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的病毒性肝炎診斷標準，并排除合并有其它肝臟疾病(甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、Wilson's 病)、可引起高代謝的疾病(包括糖尿病, 獲得性免疫缺陷綜合癥，甲狀腺功能亢進)、伴隨嚴重的心血管系統、呼吸系統以及腎功能損害和年齡不滿18歲的患者。433例HBV感染者的臨床分型為47例無癥狀攜帶者(Asymptomatic carriers，ASC)，154例慢性肝炎(Chronic hepatitis，CH)，130例肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和102例肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。健康對照者208例，為中國陜西籍或長期居住在陜西地區無血緣關系的健康獻血員和健康體檢者，其中男151例，女57例；平均年齡(38.17±14.22)歲。兩組在年齡與性別間的差異均無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象均知情同意和自愿參加。

1.2 DNA提取 所有受試者清晨空腹抽血2 mL，用EDTA抗凝后，-20℃冷凍保存待提取人類基因組DNA。用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3 基因型分析 采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術進行基因型分析[8-9]。引物序列、內切酶、產物長度見表1。

表1 PD-1和CTLA-4基因多態性使用的引物序列、內切酶、PCR產物長度Table 1 Primer sequences, endonucleases, PCR product lengths used for PD-1 and CTLA-4 gene polymorphisms

1.4 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析?；蛐皖l率用Hardy-Weinberg平衡檢驗。HBV感染組與健康對照組的基因型頻率、等位基因頻率、基因間的交互作用、與疾病嚴重程度的關系，用2檢驗進行計算。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-1和CTLA-4的基因型和等位基因頻率 PD-1 rs10204525 A/G和CTLA-4 rs3087243 A/G基因型在HBV感染組和健康對照組的的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，見表2。 PD-1 rs10204525、CTLA-4 rs3087243在HBV感染組和健康對照組中的差異均有統計學意義。PD-1 rs10204525：與GG基因型相比，慢性HBV感染組的AA基因型頻率明顯高于健康對照組(P=0.019,OR=2.231, 95%CI=1.127～4.418)，A等位基因頻率明顯高于健康對照組(P=0.033,OR=1.334, 95%CI=1.024～1.739)。CTLA-4 rs3087243：與AA基因型相比，慢性HBV感染組的GG基因型頻率明顯高于健康對照組(P=0.016,OR=2.196, 95%CI=1.145～4.214)，G等位基因頻率明顯高于健康對照組(P=0.040,OR=1.320, 95%CI=1.012～1.723)。見表3。

表2 H-W平衡檢驗Table 2 Hardy-Weinberg equilibrium

表3 PD-1和CTLA-4的基因型和等位基因分析[n,n(×10-2)]Table 3 Genotype and allele frequencies of PD-1 and CTLA4 polymorphisms

2.2 PD-1和CTLA-4的基因型交互作用 以HBV易感基因型PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)作為參照，因PD-1 rs10204525(GG)、CTLA-4 rs3087243(AA)基因型太少，遂分別將二者少見基因型合并分析。發現組合基因型在HBV感染組和健康對照組中的差異有統計學意義，見表4、5。與PD-1 rs10204525(GG)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在慢性HBV感染組的分布頻率高于健康對照組(P=0.009,OR=5.298, 95%CI=1.338～20.983)。與PD-1 rs10204525(AA)基因型使乙肝的發病危險性升高2.231倍相比，CTLA-4 rs3087243(GG)基因型顯著升高了基于PD-1 rs10204525基礎上的乙肝發病危險。與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在慢性HBV感染組的分布頻率高于健康對照組(P=0.002,OR=4.995, 95%CI=1.684～14.820)。與CTLA-4 rs3087243(GG)基因型使乙肝的發病危險性升高2.196倍相比，PD-1 rs10204525(AA)基因型顯著升高了基于CTLA-4 rs3087243基礎上的乙肝發病危險。

表4 將攜帶有CTLA-4少見基因型合并后的組合基因型分析Table 4 Combined genotype analysis after combining rare genotypes with CTLA-4

表5 將攜帶有PD-1少見基因型合并后的組合基因型分析Table 5 Combined genotype analysis after combining rare genotypes with PD-1

2.3 PD-1和CTLA-4基因型和等位基因與疾病嚴重程度的關系 將HBV感染組按疾病嚴重程度分為無癥狀攜帶者、慢性肝炎、肝硬化和肝癌組，發現PD-1 rs10204525各組間差異無統計學意義，CTLA-4 rs308724基因型和等位基因各組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。進一步組間分析發現，PD-1 rs10204525各組間差異無統計學意義(P>0.05)。而在CTLA-4 rs308724組中，與GA基因型相比，ASC組的GG基因型頻率低于HCC組(P=0.026,OR=0.411, 95%CI=0.154～0.508)，ASC組的G等位基因頻率低于HCC組(P=0.018,OR=0.483, 95%CI=0.263～0.888)；與GA基因型相比，CH組的GG基因型頻率低于HCC組(P<0.001,OR=0.279, 95%CI=0.172～0.568)，G等位基因頻率低于HCC組(P<0.001,OR=0.442, 95%CI=0.277～0.704)；與GA基因型相比，LC組的GG基因型頻率低于HCC組(P<0.001,OR=0.336, 95%CI=0.182～0.620)，G等位基因頻率低于HCC組(P=0.012,OR=0.541, 95%CI=0.332～0.879)。提示CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能與HCC感染相關。

表6 PD-1和CTLA-4的基因型和等位基因與疾病嚴重程度的關系Table 6 Genotype and allele frequencies of PD-1 and CTLA-4 polymorphisms in hepatitis B virus infected patients with different clinical diagnoses

2.4 PD-1和CTLA-4組合基因型與疾病嚴重程度的關系 以HBV易感基因型PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)作為參照，因PD-1 rs10204525(GG)、CTLA-4 rs3087243(AA)基因型太少，遂將二者少見基因型合并分析，發現組合基因型在各組中的差異有統計學意義(P<0.05)，見表7。進一步組間分析發現：與PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在ASC組、CH組的分布頻率分別低于HCC組(P=0.013,OR=0.233, 95%CI=0.070～0.779和P=0.001,OR=0.197, 95%CI=0.071～0.543)；與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4rs3087243(GG)組合基因型組在CH組的分布頻率低于HCC組(P=0.045,OR=0.515, 95%CI=0.268～0.990)；與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在LC組的分布頻率高于HCC組(P=0.007,OR=2.847, 95%CI=1.314～6.165)；與PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在CH組的分布頻率低于LC組(P=0.029,OR=0.452, 95%CI=0.219～0.932)。

表7 PD-1和CTLA-4組合基因型與疾病嚴重程度的關系Table 7 Combined analysis of PD-1 and CTLA-4 polymorphisms in hepatitis B virus infected patients with different clinical diagnoses

2.5 PD-1和CTLA-4組合基因型與肝癌的關系 以HCC易感基因型PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GG)作為參照，因PD-1 rs10204525(GG)、CTLA-4 rs3087243(AA)基因型太少，遂將二者少見基因型合并分析。發現組合基因型在肝癌組和非肝癌組中的差異有統計學意義(P<0.05)，見表8。與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)、PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)、PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在非肝癌組的分布頻率低于肝癌組(分別為P<0.001,OR=0.240, 95%CI=0.119～0.482；P=0.006,OR=0.437, 95%CI=0.242～0.790；P<0.001,OR=0.116, 95%CI=0.041～0.328)。

表8 PD-1和CTLA-4組合基因型與肝癌的關系Table 8 Combined analysis of PD-1 and CTLA-4 polymorphisms in patients with or without HCC

3 討論

PD-1是一種抑制性免疫受體，屬于免疫球蛋白超家族，主要在活化的淋巴細胞，自然殺傷細胞和單核細胞中表達[10]。一旦與它的兩個配體PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)連接，PD-1可以下調T細胞增殖和活性，抑制細胞因子分泌，誘導T細胞凋亡。PD-1基因位于染色體的2q37.3，由5 個外顯子和4 個內含子組成。作為腫瘤免疫調節的關鍵靶點，PD-1和它的兩個配體基因單核苷酸多態性(SNP)變異研究主要集中于腫瘤中，也包括本研究所探討的rs10204525位點，如肺癌、結直腸癌、上消化道癌等[11-13]。隨著對PD-1研究的不斷深入，逐漸發現許多引起慢性感染的微生物都可能利用了PD-1-PD-L通路削弱抗感染免疫，并造成持續的感染狀態[14-15]。因此，對PD-1基因多態性在慢性HBV感染中的研究也逐漸進入人們的視野。位于基因3′UTR的SNP可通過與miRNA特異性結合，進而調控mRNA和蛋白的表達。已有研究發現PD-1非編碼區的基因多態性可以通過改變外周血單個核細胞(PBMC)的細胞因子產生和PD-1表達而與HBV感染的慢性和進展相關[16-18]。本研究也有類似發現，PD-1 rs10204525的AA基因型和A等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素。

CTLA-4基因同PD-1 基因一樣也位于2 號染色體上(2q33～q37)，包含4 個內含子和3 個外顯子，目前已發現若干個基因多態性位點，這些SNPs 可能影響CTLA-4 的表達量以及結構和功能。但有關CTLA-4非編碼區的基因多態性的研究卻相對較少，僅見于一些自身免疫性疾病和過敏性疾病[19-20]。本次研究探討了CTLA-4基因3′UTR的SNP差異在HBV感染中的作用。發現CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素。且CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能與HCC感染相關，這與其他研究結果一致[21]。進一步將CTLA-4和PD-1基因進行聯合分析，發現聯合基因型可增加慢性HBV感染的危險因素，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型分別增強了PD-1 rs10204525(AA)基因型(OR從2.231增至5.298)和CTLA-4 rs3087243(GG)基因型(OR從2.196增至4.995)的發病風險。

PD-1和CTLA-4作為作為T 細胞表面一種重要的抑制性共刺激分子，在免疫調節中發揮著重要的負性調節作用，并維持著外周免疫耐受[22-25]，兩者的表達水平與慢性HBV感染的發生發展密切相關。本研究發現PD-1和CTLA-4基因3′UTR的SNP差異與慢性HBV感染的發病風險相關，且兩者間存在交互作用?？赡芡ㄟ^影響基因3′UTR 與miRNA的結合，進而影響PD-1 和CTLA-4的表達水平，最終影響慢性乙型肝炎的發病風險。這可能有助于深入了解它們在遺傳學上與HBV 感染易感性、疾病進展以及結局的關系，為HBV 感染基于基因信息的個體化防治提供新的策略。

4 結論

PD-1 rs10204525的AA基因型和A等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素，CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素。聯合基因型可增加慢性HBV感染的危險因素。CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能與HCC感染相關。