疫苗佐劑單磷酸脂質A的合成及在疫苗中應用進展

汪緒龍， 李 雪， 馬曉雪， 周成凱， 隋 強*

疫苗佐劑單磷酸脂質A的合成及在疫苗中應用進展

汪緒龍1,2， 李 雪2， 馬曉雪1， 周成凱1， 隋 強1*

（1. 上海工程技術大學 化學化工學院，上海 201620；2. 中國醫藥工業研究總院，上海 201203）

簡單介紹了單磷酸脂質A（monophosphoryl lipid A）的來源及化學結構，單磷酸脂質A是革蘭氏陰性菌外膜上脂多糖內層脂質A的部分結構?？偨Y了單磷酸脂質A常用的兩條合成路線并分析優缺點，指出路線2為最佳的合成方法，其巧妙的選取Nap作為保護基，用DDQ干凈高效地脫除了Nap保護基，避免使用催化氫化，相比路線1更加適合工藝放大研究?；瘜W合成與生物提取相比，避免了糖異質及純度低的問題。最后總結了單磷酸脂質A作為佐劑在各類疫苗中的應用，為其進一步研究提供參考。

單磷酸脂質A；脂多糖；合成；Nap；佐劑；疫苗

單磷酸脂質A（Monophosphoryl Lipid A）是革蘭氏陰性菌細胞壁中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）中的最內層脂質A部分[1]。LPS是一個復雜分子，由三個結構區域組成：脂質A（Lipid A，內毒素）、非重復核心寡糖和-抗原（圖1左），可以有效地引發機體產生炎癥反應，導致各種生理病理效應[2-4]。LPS結構中的疏水部分脂質A是一種很強的免疫刺激劑，含有數條脂肪?；?，能被Toll樣受體4（TLR4）和髓樣分化因子（MD-2）蛋白受體所識別，從而刺激相應的免疫細胞，如巨噬細胞、樹突細胞等，產生免疫反應[5-7]。脂質A的骨架結構為-D-GlcN-(1→6)-D-GlcN，并含有1,4?-二--磷酸基團，會過度激活先天性免疫應答，從而導致敗血性休克等癥狀，副反應強烈。研究表明，去掉1位的磷酸基團，即為單磷酸脂質A（圖1右），其毒性降低且保留了免疫活性[8-11]。Ribi等研究了單磷酸脂質A的致死性，發現其毒性僅為LPS的0.08%，證明了單磷酸脂質A的低毒性與安全性，很大程度上避免了由LPS引起的副反應[12]。研究發現，單磷酸脂質A能刺激免疫細胞并產生細胞因子，如TNF-（腫瘤壞死因子-）、IFN-（干擾素-）、IL-6（白細胞介素-6）等，進一步證明單磷酸脂質A作為佐劑的有效性，為其作為疫苗佐劑奠定 基礎[13]。

目前，單磷酸脂質A在疫苗治療中已作為佐劑投入市場，與疫苗配合使用能夠顯著增強抗體反應和T細胞調節免疫反應[14]。上文已簡單介紹了單磷酸脂質A的來源和結構，下文將重點分析總結單磷酸脂質A的化學合成方法，最后介紹單磷酸脂質A作為佐劑在疫苗中的應用，為單磷酸脂質A類化合物作為佐劑在其他疫苗中的應用提供參考。

圖1 LPS（左）和單磷酸脂質A（右）的一般結構

1 單磷酸脂質A合成路線綜述

1.1 單磷酸脂質A合成所存在的問題

目前大部分單磷酸脂質A來源依靠于生物發酵提取，即先從細菌中提取，后經化學酸解得到。該方法的缺點是成本高，同時，通過培養的革蘭氏陰性菌分離得到的單磷酸脂質A具有糖異質性問題[15]。例如：SJ-19a類脂質A在酸水解步驟中，會發生化學降解從而導致脂質A的異質性[16]。因此，采用化學合成的方法獲得明確結構的單磷酸脂質A是十分必要的。

1.2 單磷酸脂質A的逆合成分析及目標化合物的合成

圖2為單磷酸脂質A的逆合成分析圖。

圖2 單磷酸脂質A的逆合成分析

由圖2可知，單磷酸脂質A類化合物的合成可概括為：1）糖受體與糖供體的制備，2）糖苷化形成二糖并連接相應的脂肪鏈，3）脫除保護基得到終產物。

單磷酸脂質A的合成路線1和合成路線2如圖3所示。單磷酸脂質A兩種合成路線對比如表1所示。

圖3 單磷酸脂質A的合成路線1和合成路線2

表1 單磷酸脂質A兩種合成路線對比

由圖3與表1可知，對比分析了兩種單磷酸脂質A的合成路線。路線1：糖供體1和糖受體2經糖苷化反應、Alloc保護、選擇性開環、安裝磷酸基團、脫除Troc保護基、連接脂肪鏈、脫除Alloc和TDS保護基，最后氫化脫除Bn得到目標化合物7[17]。該路線使用Bn為永久性保護基，需采用Pd/C在氫氣條件下脫除，此步雜質多，后三步收率僅為68%。而且因為單磷酸脂質A為兩親性結構，氫化脫除時會形成膠束使得芐基脫除較為困難，從而導致終產物純化方式復雜，如需要使用多個不同組分的混合溶劑作為流動相才能沖出產物[18]。

路線2：糖供體8和糖受體9經糖苷化反應、脫Troc保護基、連接脂肪鏈、脫Fmoc保護基、連接脂肪鏈、脫TDS和Allyl保護基，最后用DDQ將Nap脫除得到目標化合物12[19]。路線2采用了Nap代替Bn來保護糖環上的羥基和脂肪鏈上羥基，改用DDQ氧化脫除Nap，避免了催化氫化[20-21]。此方法大幅度提高了收率，且后處理較為簡單。路線2反應步驟較少，能耗少、收率高，反應條件溫和、易于操作，相比路線1更加適合工藝放大研究。

2 單磷酸脂質A在疫苗中的應用

2.1 含單磷酸脂質A的AS佐劑系統

由于單一佐劑有其使用的局限性，因此現有疫苗中大多會添加兩種以上的佐劑組成佐劑系統[22-23]。目前含有單磷酸脂質A的AS佐劑系統見表2。

表2 常用的AS佐劑系統

QS21：從皂樹樹皮中提取的三萜糖苷類物質；CpG：TLR樣9配體

佐劑系統不同的配伍會影響到佐劑的免疫應答效果和副作用。Burny等[24]對部分佐劑系統的免疫原性進行比較，將AS系列、鋁佐劑分別與HBV抗原結合后接種于人體，其適應性和體內免疫反應的效果為：AS01＞AS03＞AS04＞Alum，與四價HPV疫苗組合接種于人體后，AS01系統的特異性免疫抗體濃度最高[25]。

2.2 已上市含單磷酸脂質A的疫苗

另外在已上市的疫苗中，單磷酸脂質A也展現出了其強大的免疫增強效應（見表3）。

表3 已上市的含MPLA佐劑疫苗

FendrixTM：GSK研制的乙肝疫苗，該疫苗由乙肝病毒（HBV）表面抗原和AS04佐劑系統組成，用于預防和治療由感染乙型肝炎病毒（HBV）引起的乙型肝炎。相比于傳統鋁佐劑乙肝疫苗，注射FendrixTM可以快速誘導更高水平的抗體滴度并且長時間維持保護機體的狀態。注射部位出現嚴重疼痛、腫脹和發紅的人數相對減少了5%[27]。

CervarixTM與 GardasilTM：宮頸癌主要是由感染兩種高危型病毒株（HPV-16/18型）導致的，CervarixTM是由GSK研制的宮頸癌二價疫苗，由HPV L1表位的病毒樣顆粒（VLP）與AS04系統組成；GardasilTM是由默克研發的宮頸癌四價疫苗，也含有AS04佐劑，除含有HPV-16/18型外，還含有HPV-6/11型，這兩種疫苗均用于預防人類乳頭狀瘤病引起的子宮頸癌等疾病[28]。

ShingrixTM：由GSK研制的帶狀皰疹疫苗，使用AS01佐劑系統[29]。在沒有廣泛接種痘疫苗時，北美近90%的人群得過水痘帶狀皰疹（VZV），約 20%的成年人會在其一生中發展為帶狀皰疹。2018年，VZV糖蛋白E佐劑亞單位疫苗（ShingrixTM）被批準用于成年人預防帶狀皰疹[27]。

MosquirixTM（RTS，S/AS01）：由GSK研制的瘧疾疫苗，其組分包括重組惡性瘧原蟲環子孢子蛋白（RTS）、乙型肝炎表面抗原（S）和AS01。在針對兒童（5至17個月）和嬰兒（6至12周）的III期研究中，疫苗對兒童的有效性高于嬰兒，是第一個針對惡性瘧原蟲的疫苗[29-30]。

3 總結與展望

本文簡單介紹了單磷酸脂質A類化合物的來源、結構以及含單磷酸脂質A的AS佐劑系統。單磷酸脂質A具有比傳統鋁鹽佐劑更強的免疫活性、有效性和安全性，列舉了其作為佐劑在上市疫苗中的應用。重點分析了兩條化學合成單磷酸脂質A的路線，其中路線2更適于工藝研究，選取Nap作為保護基，最后用 DDQ 干凈高效地脫除了Nap保護基，避免使用催化氫化，大幅提高了收率。但是，目前單磷酸脂質A的全合成依舊停留在毫克級別，還未大規模生產以商業化應用。因此，希望本文分析總結的單磷酸脂質A的合成方法，對其今后合成工藝研究以及工業化生產提供參考和幫助。

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Progress in the Synthesis of Vaccine Adjuvant Monophosphoryl Lipid A and Its Application in Vaccines

WANG Xu-long1,2, LI Xue2, MA Xiao-xue1, ZHOU Cheng-kai1, SUI Qiang1*

（1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai University of Engineering Science, Shanghai 201620, China;2. China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China）

This paper briefly introduced the source and chemical structure of monophosphoryl lipid A, which is part of the structure of lipopolysaccharide inner layer lipid A on the outer membrane of Gram-negative bacteria. Two common synthetic routes of monophosphoryl lipid A were summarized, and their advantages and disadvantages were analyzed. It is pointed out that route 2 is the best synthetic method, which cleverly selected Nap as the protecting group. The Nap protective group was removed cleanly and efficiently with DDQ to avoid the use of catalytic hydrogenation, which was more suitable for process amplification research than route 1. Compared with biological extraction, chemical synthesis avoided the problems of sugar heterogeneity and low purity. Finally, the application of monophosphoryl lipid A as adjuvant in various vaccines was summarized, so as to provide reference for the further research of monophosphoryl lipid A.

monophosphoryl lipid A; lipopolysaccharide; synthesis; 2-naphtylmethyl; adjuvant; vaccine

2021-12-20

“重大新藥創制”科技重大專項（2013ZX09301302-X-5）。

汪緒龍（1995～），男，安徽六安人，碩士；主要從事藥物合成研究。

隋強（1977～），男，研究員，碩士生導師；主要從事糖疫苗佐劑研究。

R186.3

A

1009-220X(2022)03-0001-07

10.16560/j.cnki.gzhx.20220308