鹽分對不同種植年限水稻土氮轉化功能基因的影響

肖錨，俞永祥，姚槐應，*

(1. 武漢工程大學 環境生態與生物工程學院，武漢 430205；2. 中國科學院 城市環境研究所，福建 廈門 361021)

土壤鹽漬化引起的土壤退化是全球典型的生態問題。目前，中國鹽堿地總面積約3.6×107hm2，其中超過 1.3×106hm2位于濱海區域[1]。將濱海鹽堿灘涂圍墾成農田，實現了從鹽堿地到可利用耕地的轉變，緩解了耕地不足的現狀。然而，鹽分也是限制濱海稻田土壤養分循環與利用的關鍵制約性因子。鹽分升高會改變土壤理化性質和微生物群落的功能[2-3]，進而改變了土壤氮素循環過程。在農田生態系統，氮素是限制農作物產量的關鍵因素，土壤微生物驅動下有機氮的分解作用、銨態氮的硝化作用和硝態氮的反硝化作用是決定農作物氮素利用效率的關鍵[4]。鹽分增加通常會抑制土壤硝化和反硝化微生物活性[5]，進而限制了土壤氮素供應和轉化過程。當前關于鹽分對土壤氮素轉化及其微生物調控機制的研究開展較多[6-7]，但鹽分對土壤氮轉化的微生物功能基因的研究較少。Zhou等[8]基于meta分析方法，發現鹽漬化顯著增加了土壤銨態氮含量，降低了土壤硝態氮含量，但對土壤硝化和反硝化過程的影響存在較大差異。微生物是驅動土壤氮素轉化的引擎，不同土壤中氮循環相關微生物群落的差異，可能是導致鹽漬化對土壤氮素轉化過程的影響存在較大差異的原因。將濱海灘涂圍墾成稻田是一種常見的土地利用方式，形成了具有不同種植年限的水稻土。圍墾早期的稻田土壤普遍存在含鹽量高、養分貧瘠和滲透性差等問題，土壤氮素周轉速率慢，農作物利用氮素效率低[9]。但隨著水稻種植年限的增加，水稻土中驅動養分循環的微生物豐度和多樣性逐漸穩定，而且土壤中氮素積累和消耗也達到動態平衡[10-11]。因此，稻田耕作年限增加可能會降低鹽分對土壤氮素轉化以及硝化和反硝化微生物的影響程度。然而，關于鹽分對不同種植年限水稻土氮素轉化微生物功能基因影響的研究較少。本研究以濱海稻田土壤為研究對象，探究鹽分對不同種植年限稻田土壤礦質氮及氮素轉化功能基因的影響，以期為“防止土壤鹽漬化，提高土壤生產力”提供數據支撐。

1 試驗材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采集自江蘇省鹽城市不同種植年限(3年、15年和40年)的水稻田(32°50′3″N～32°56′51″ N，120°28′28″ E～120°56′39″ E)，該地區屬于亞熱帶季風氣候，多年平均氣溫為14.8℃，多年平均降水量為1 015.0 mm。采用棋盤法采集土壤表層土(0～20 cm)并充分混勻。挑出土壤中根、莖和石頭等雜物后過2 mm篩，在4℃下儲藏備用。試驗前測定的土壤基本理化性質見表1。供試土壤長期冷藏保存后土壤硝態氮含量較高，主要歸因于低溫保存雖然抑制了土壤凈氮礦化和銨態氮消耗，但會增加土壤凈硝化和硝酸鹽固持速率[12]。不過，本試驗中冷藏保存的土壤經過兩周的預培養后，硝態氮含量會接近新鮮土壤樣品[13]，最大限度保證了試驗結果的可靠性。

1.2 試驗設計

為探究水稻種植年限和鹽分的交互作用對礦質氮及氮素轉化微生物功能基因的影響，試驗處理如下：(1)供試水稻土種植年限分別為3年、15年和40年；鹽堿化水稻土種植15年后，土壤微生物多樣性逐漸穩定，氮素轉化過程也達到動態平衡[10]。(2)0.2%和0.6%和鹽分，分別代表中度鹽漬化與重度鹽漬化[9]。試驗共6個處理，每個處理3個重復。

試驗開始前，稱取干重為15 g的水稻土置于120 mL血清瓶中進行兩周的培養。對于0.2%含鹽量處理，對不同耕作年限水稻土中加入相應的超純水，使得土壤水含量達到飽和狀態。對于0.6%含鹽量處理，按照Kester人工海水配方比例[14]，向土壤加入NaCl∶Na2SO4∶KCl∶NaHCO3比為23.93∶4.01∶0.68∶0.20的鹽分溶液。本試驗中，供試3年、15年和40年種植年限的水稻土中添加的鹽分總量分別為55.5、61.5和59.25 mg，并調節土壤含水量至飽和狀態。最后，將裝有供試水稻土的血清瓶放在25℃培養箱中，并加入0.15 g(1%)的水稻秸稈(碳、氮和碳氮比分別為38.59%、0.92%和41.91%)，充分混勻，用于提高微生物活性。培養期間按照稱重法補充土壤水分，并在第48天進行破壞性取樣，用于測土壤礦質氮含量及土壤氮轉化的微生物功能基因。

1.3 土壤礦質氮含量及氮轉化微生物功能基因的測定

將3 g鮮土加入15 mL的2 M KCl溶液中振蕩1 h后，通過濾紙過濾獲取浸提液，采用流動分析儀(Skalar SAN++ System, Skalar Analytical B.V., Breda, Netherlands)測定土壤銨態氮(NH4+)和硝態氮(NO3-)含量。

將部分土樣置于-80℃下冷凍干燥處理后，按照土壤DNA提取試劑盒(FastDNATMSPIN Kit for soil)提供的方法提取500 mg土壤樣品中的DNA。以16S rRNA基因(F515/R907)作為參考基因，使用高通量定量PCR方法測定編碼氮礦化(gdhA)、硝化(AOAamoA、AOBamoA、amoB、hao和nxrA)和反硝化(narG、nirK1、nirK2、nirS1、nirS2、nosZ1和nosZ2)有關的微生物功能基因相對豐度。PCR條件是：95℃預變性10 min；95℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共擴增40個循環，PCR擴增的引物及其序列詳見表2[15]。SmartChip qPCR軟件自動剔除有多個WaferGen自動生成的溶解曲線以及擴增效率>120%或<80%的結果，選擇小于31的結果閾值(CT)計算基因相對豐度(GR)[16]：

表2 本研究中用于PCR擴增的引物及其序列Table 2 Primers and their sequences for PCR amplification in this study

基因相對拷貝數GR=(31-CT)/(10/3)

(1)

為計算氮轉化功能基因的絕對豐度(GAfun)，按照Zheng等[16]采用的方法計算：

基因絕對拷貝數GAfun=GA16s·GRfun/GR16S

(2)

式(2)中：GA16s和GR16S分別表示16S rRNA基因的絕對豐度和相對豐度，GAfun和GRfun分別表示不同氮轉化功能基因的絕對豐度和相對豐度。16S rRNA絕對豐度采用qPCR測定。

1.4 數據處理與統計分析

用Excel 2019統計并處理數據，用SPSS 26軟件對數據進行單因素及雙因素方差分析，用Origin 2021軟件做圖，圖中的誤差棒均為標準誤差。不同處理之間的多重比較采用最小顯著法(LSD)，用不同小寫字母表示不同處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 鹽分對不同種植年限水稻土礦質氮的影響

鹽分以及鹽分與水稻種植年限的交互作用顯著(P<0.05)影響了土壤NH4+含量(圖1a)。對于種植3年的水稻土，鹽分對土壤NH4+沒有顯著(P>0.05)影響，0.2%和0.6%含鹽量的土壤NH4+含量分別為0.69和0.74 mg·kg-1。對于種植15年和40年的水稻土，鹽分增加顯著(P<0.05)提升了土壤NH4+含量。0.2%和0.6%含鹽量下，種植15年水稻土NH4+含量分別為0.26和1.51 mg·kg-1，種植40年的水稻土NH4+含量分別為0.21和0.32 mg·kg-1。

鹽分以及鹽分與水稻種植年限的交互作用對土壤NO3-沒有顯著影響(P>0.05)(圖1b)。對于種植3年和15年的水稻土，鹽分對土壤NO3-沒有顯著(P>0.05)影響。0.2%含鹽量下，3年和15年水稻土NO3-含量分別為1.53和1.66 mg·kg-1；而0.6%含鹽量下，3年和15年水稻土NO3-含量分別為1.38和1.46 mg·kg-1。鹽分增加顯著(P<0.05)降低了種植40年水稻土NO3-含量，0.2%和0.6%含鹽量土壤NO3-含量分別為1.12和0.85 mg·kg-1。

2.2 鹽分對不同種植年限水稻土氮轉化功能基因的影響

基于高通量定量PCR技術，共檢測到編碼氮礦化(gdhA)、硝化(AOBamoA和amoB)和反硝化(narG、nirK、nirS和nosZ)轉化酶的微生物功能基因。不同水稻土中，編碼亞硝酸鹽還原酶的nirS基因豐度相對較高(1.42×107～4.38×107)，其次為編碼氮礦化酶的gdhA(1.99×106～5.66×106)、氧化亞氮還原酶的nosZ基因(1.43×106～5.24×107)和氨氧化細菌硝化的amoA(1.63×105～1.71×106)；而編碼硝酸鹽還原酶的narG(3.25×104～5.32×104)和亞硝酸鹽還原酶的nirK(2.55×104～1.43×105)基因豐度相對較低(圖2)。

鹽分、水稻土種植年限及其交互作用顯著(P<0.05)影響了gdhA、amoA和amoB基因豐度(表3，圖2)。對于水稻土有機氮礦化過程，鹽分增加對種植3年的水稻土gdhA基因沒有顯著影響，但使得種植15年和40年水稻土gdhA基因豐度顯著增加。對于水稻土硝化過程，鹽分對不同種植年限的amoA和amoB基因的影響存在差異。鹽分增加使得種植3年和15年的水稻土amoA基因豐度顯著降低，但對種植40年水稻土amoA基因豐度沒有顯著影響。鹽分增加分別使得種植3年、15年和40年水稻土amoB基因豐度顯著降低、無顯著影響和顯著增加。

表3 鹽分、水稻種植年限及其交互作用對氮循環功能基因的影響Table 3 Salinity，cultivated years and their interaction effects on microbial functional genes involved in nitrogen transformation

反硝化過程中，鹽分及其與水稻土種植年限的交互作用對narG和nirS基因沒有(P>0.05)顯著影響(表3，圖2)，鹽分增加僅使得種植40年的水稻土narG基因豐度顯著(P<0.05)增加。鹽分、水稻種植年限及其交互作用對nirK和nosZ基因均產生顯著影響(P<0.05)。對于亞硝酸鹽還原過程，鹽分增加使得種植15年和40年水稻土nirK基因豐度顯著增加，對種植3年的水稻土nirK基因沒有顯著影響。對于N2O還原過程，鹽分增加使得不同種植年限水稻土的nosZ基因豐度均顯著增加。

2.3 土壤理化性質與氮轉化功能基因的相關性分析

土壤理化性質(鹽分、有機碳、銨態氮和硝態氮)可解釋土壤氮轉化微生物功能基因74.2%的變異(圖3)。NH4+與gdhA基因和amoB基因呈正相關關系，與AOBamoA基因相關性不大，而NO3-與amoB存在正相關關系，與其他硝化和反硝化功能基因相關性不大。鹽分含量與nosZ基因呈正相關關系，與AOBamoA呈負相關關系。土壤有機碳含量與nirK、nirS和gdhA呈正相關關系，與AOBamoA呈負相關關系。

3 討論

鹽漬化通常會抑制土壤微生物的生長和活性，進而降低了微生物驅動下的土壤有機氮礦化速率[8,17]。但Zhou等[8]基于meta分析發現，鹽分增加提升了土壤有機氮的凈礦化速率，但抑制了NH4+的生物固持，進而顯著增加了土壤NH4+含量。結果發現，水稻土熟化程度可能控制了鹽分對土壤有機氮礦化及NH4+含量的影響。對于種植15年和40年的水稻土，鹽分增加使得編碼土壤有機氮礦化酶的gdhA基因豐度增加，進而通過促進土壤有機氮礦化增加了土壤NH4+含量。但對于種植3年的水稻土，鹽分增加對土壤NH4+含量和gdhA基因豐度均沒有顯著影響。究其原因，可能是種植水稻15年后，土壤氮素累積和消耗的動態平衡以及微生物群落演化均達到穩定狀態[10]，使得鹽分對土壤有機氮礦化存在顯著影響。但種植3年的水稻土微生物豐富度和多樣性可能較低[10]，鹽分對微生物驅動下土壤礦化過程的影響存在較大的不確定性，導致鹽分對土壤有機氮礦化沒有顯著影響。

鹽漬化會改變土壤氨氧化微生物群落結構和功能，進而對土壤硝化過程存在低鹽促進、高鹽抑制的作用[18-19]。本研究的冗余分析結果與前人研究結果一致，水稻土氨氧化細菌的amoA豐度與鹽分呈負相關關系，表明鹽分增加抑制了土壤氨氧化細菌功能基因的表達。不過，李明[20]等發現枸杞園土壤氨氧化古菌對鹽分變化不敏感，表明鹽分對氨氧化細菌和氨氧化古菌的影響存在較大差異。因此，在考慮鹽分對土壤氨氧化過程中，應定量區分鹽分對氨氧化細菌和古菌對土壤硝化過程的相對貢獻。此外，鹽分對不同種植年限水稻土氨氧化細菌的影響存在較大差異。對于種植3年和15年的水稻土，較高鹽分水平下水稻土amoA基因豐度較低，可能抑制了土壤硝化過程。但對于種植40年的水稻土，鹽分對水稻土amoA基因豐度沒有顯著影響。該結果表明，隨著水稻土逐漸熟化，鹽分對土壤氨氧化細菌的影響程度逐漸降低。水稻是喜銨植物，對于熟化程度較低的水稻土，鹽漬化除了對水稻生長產生脅迫外，還可能抑制土壤硝化速率，不利于水稻利用有機氮分解產生的氮素。因此，在濱海鹽堿灘涂圍墾成農田前期，除了種植具有耐鹽能力的水稻外，應適當增加銨肥輸入量，保證作物產量。

較高的鹽分含量會抑制土壤硝化過程，減少可供土壤反硝化微生物利用的NO3-底物，進而降低土壤反硝化速率[21]。但Zhou等[8]基于meta分析發現，鹽分對土壤硝化過程以及土壤NO3-含量均沒有顯著影響，可能是土壤中參與氮循環的相關微生物存在較大差異，減緩了鹽漬化對土壤反硝化過程的限制作用。本研究結果表明，鹽分使得種植3年和15年的水稻土氨氧化細菌amoA豐度降低，但并未顯著影響土壤NO3-含量；對于有40年種植歷史的水稻土，鹽分增加使得編碼硝化過程的amoB基因豐度顯著增加，但也使得編碼硝酸鹽還原酶的narG基因豐度增加，進而使得土壤NO3-含量顯著降低。不僅如此，鹽分增加還會抑制硝酸鹽還原產生的亞硝酸鹽氧化過程[17]，導致亞硝酸鹽的積累，并對水稻生長產生毒害。稻田土壤通常處于淹水環境，土壤中氧氣不足，更有利于亞硝酸鹽積累。因此，對于熟化程度較高的鹽漬化水稻田，需要適當開展排水曬田，減輕亞硝酸鹽污染對水稻生長產生的危害。

土壤鹽漬化會抑制土壤反硝化過程，鹽分過高甚至使得土壤反硝化過程完全終止[17]。有研究發現鹽分增加會減少沉積物中nirK和nosZ基因豐度，但對nirS基因沒有顯著影響[22]，即鹽分增加會抑制土壤反硝化過程中的亞硝酸鹽和N2O還原過程。而本研究發現鹽分增加使得nirK和nosZ基因豐度顯著增加，但對nirS基因沒有顯著影響，可能歸因于水稻土中編碼nirS功能基因的微生物活性較高[23]，對鹽分增加具有更高的抵抗力有關。不同種植年限的水稻土，較高的含鹽量下nosZ基因豐度較高，可通過促進水稻土N2O還原過程而減少N2O排放。因此，在估算鹽漬化稻田土壤溫室氣體排放過程中，需要考慮鹽分對土壤N2O排放的抑制作用。不過，有研究發現鹽漬化雖然增加了編碼N2O還原酶的nosZ功能基因豐度，但可能通過增加真菌反硝化強度，進而存在較高的土壤N2O排放風險[24]。因此，未來需要結合大田試驗，探究鹽分增加對不同耕作年限水稻土N2O排放的影響，量化真菌反硝化過程對土壤N2O釋放量的貢獻。

4 結論

1)鹽分對稻田土壤有機氮礦化及土壤NH4+含量的影響受水稻種植年限的影響。對于種植15年和40年的水稻土，鹽分增加使得編碼土壤有機氮礦化的gdhA基因豐度增加，進而提升了土壤NH4+含量；但對于種植3年的水稻土，鹽分對gdhA基因豐度和NH4+含量均沒有顯著影響。

2)鹽分對土壤NO3-含量的影響取決于水稻種植年限。對于種植40年的水稻土，鹽分增加使得編碼NO3-還原酶的narG基因豐度增加，進而使得土壤NO3-含量顯著降低。對于種植3年和15年的水稻土，鹽分對narG基因豐度和NO3-含量沒有顯著影響。

3)對于不同水稻種植年限的土壤，鹽分增加均使得編碼N2O還原酶的nosZ基因豐度顯著增加，可能利于提升水稻土N2O還原強度，進而減少土壤N2O排放。