農藥對鳥類的高級階段風險評估方法

周艷明，袁善奎，單煒力

(農業農村部農藥檢定所，北京 100125)

農藥對鳥類的潛在影響早已引起人們的關注。歐盟于2002年發布了農藥對鳥類和哺乳動物風險評估的導則[1]，規定了農藥對鳥類和哺乳動物的風險評估方法，并于2009年修訂[2]。美國環保署(Environmental Protection Agency，EPA)于1998年發布了《生態風險評估導則》[3]，概述了農藥生態風險評估的原理，但未提供具體的評估方法。美國EPA下設的農藥項目辦公室(Office of Pesticide Program)2004年發布的《生態風險評估過程概述》[4]中給出了對陸生動物(鳥類和哺乳動物)的評估方法。

我國目前已建立農藥對鳥類的風險評估方法[5]，但該標準中僅規定了高級階段評估可考慮的部分因素，未詳細描述具體的試驗和評估方法。根據《農藥登記資料要求》[6]，申請農藥登記時需提供對鳥類的急性、短期和繁殖毒性試驗報告以及對鳥類的風險評估報告。當初級階段風險評估表明對鳥類的風險不可接受時，可進行高級階段試驗與評估。本文綜述了農藥對鳥類的高級階段風險評估方法，當初級階段風險評估表明風險不可接受時，可從以下方法中選擇1種或多種方法開展高級階段風險評估。

1 測定鳥類食物中的農藥殘留量

在初級評估中使用農藥的施藥劑量和單位劑量殘留量估算鳥類食物中農藥的殘留量，在高級評估中，可使用農藥在鳥類食物(植物、昆蟲等)的實測殘留量。如果指示物種以攝食植物為主，可考慮使用農藥登記殘留資料中的數據。殘留資料中可能有初始殘留量及殘留物消解動態方面的信息，但需注意殘留試驗中檢測的植物部分與指示物種的食物是否相符。如果指示物種以攝食昆蟲為主，可開展試驗測定昆蟲的農藥殘留水平。收集昆蟲的方法包括用網捕捉、用棍子敲打樹木并收集掉落的昆蟲或設置陷阱等，根據初級評估結果及鳥類可能攝入的昆蟲類型確定。收集的昆蟲應是鳥類可能攝入的昆蟲。用不同方法采集的樣品需分別保存并檢測。

如果試驗中農藥按標簽中的使用方法多次使用，并在最后一次使用后采樣，則暴露評估中不使用多次施藥因子。在急性評估中取初始殘留量的第90百分位，短期評估中取初始殘留量的算數平均值，長期評估中取時間加權平均殘留量。

在設計試驗時，應考慮以下因素：

(1)施藥方法應符合最糟糕情況下的良好農業規范(GAP)。

(2)試驗地點和條件應有代表性，通常需在多地點進行試驗。

(3)應根據初級評估結果確定采樣時間和采樣次數。例如，初級風險評估表明對鳥類存在較高的急性風險，則應在施藥后立即采樣；初級風險評估表明對鳥類存在短期或長期風險，則試驗中采樣時間點的數量應能確定被試物在鳥類食物中的半衰期。

2 優化多次施藥因子和時間加權平均因子

在初級評估中，使用默認的半衰期10 d計算多次施藥因子(MAF)和時間加權平均因子(ftwa)，高級階段評估時，可使用消解半衰期數據優化MAF和ftwa。

Willis和McDowell[7]綜述了81種有效成分在多種植物上的450個半衰期，總殘留物的半衰期平均值和標準偏差為：有機氯農藥，5.8±6.0d；有機磷農藥，3.3±2.6d；氨基甲酸酯類農藥，2.7±1.2d；擬除蟲菊酯類農藥，5.9±5.0d?？墒褂脷埩糍Y料中施藥后最初幾周的消解動態數據計算農藥的半衰期。

對于昆蟲，遷移和繁殖引起的個體替代將導致種群中殘留物的減少，多次施用對棲息在葉片的昆蟲中不會出現明顯累積，因此計算昆蟲中殘留量時可不使用MAF[1]。

在初級評估中基于3周時間、半衰期=10d計算ftwa。歐盟2002年指南[1]中注明，“沒有合理的科學依據也沒有普遍接受的規則來規定求平均值的時間段應多長。大多數專家不同意簡單的使用試驗時間。除非有充分的理由縮短或延長，否則目前將求平均值的時間段定為3周?！?。鳥類繁殖毒性試驗中給藥周期至少為20周，通常為22周，可使用鳥類繁殖毒性試驗周期優化ftwa。但應注意以下幾點：

(1)已采取其他優化措施時，不宜再以試驗周期優化ftwa；

(2)在鳥類繁殖毒性試驗中，暴露后很短時間即觀察到效應，或效應可歸因于敏感期的短時間暴露時，則應以該時間計算ftwa；

(3)有效成分在環境中具有持久性時，不宜以試驗周期優化ftwa；

(4)有效成分對鳥類具有內分泌干擾作用時，不宜以試驗周期優化ftwa。

3 研究鳥類的回避行為

鳥類的回避行為可顯著降低農藥的暴露。鳥類的回避行為可能由驅鳥劑或可引發厭食的有效成分導致，這種情況下在鳥類飼喂毒性試驗中可觀察到拒食現象。對于顆粒劑和種子處理劑，因助劑、顏色、形狀、質地等因素，也能觀察到鳥類的回避行為。

鳥類毒性試驗中測定飼料消耗量的可用于估算回避因子(AV)。例如，處理組的飼料消耗量是正常消耗量的10%，則AV=0.1，并可將其用于暴露量的計算。但有機磷、氨基甲酸酯等農藥在試驗開始時回避行為不明顯，在達到某個閾值劑量后才出現顯著的回避行為[2]，在此情況下在暴露評估中不能簡單的使用AV計算暴露量。

可通過試驗明確鳥類的回避行為?；乇艿某潭纫约耙幈茱L險的有效性與多種因素有關，而這些因素在實驗室和田間可能有所不同，因此目前尚無國際通行的試驗準則，但經濟合作與發展組織(OECD)1996年的鳥類毒性試驗研討會總結報告[8]中給出了研究鳥類回避行為的試驗原理、篩查方法和試驗方法的建議。開展試驗時，應選擇最能體現現實情況的設計，試驗設計的主要因素包括：

——將農藥混入基本食物作為被試物或者以顆粒劑、處理過的種子為被試物；

——試驗區域的大?。壶B籠、小鳥舍、大鳥舍；

——受試鳥單籠飼養或者成組飼養；

——給藥方式：杯子、托盤或撒在地面；

——是否提供替代食物；

——替代食物與被試物是否相似；

——暴露時間。

4 確定關鍵物種

關鍵物種是在使用農藥時出現在作物種植區域的真實鳥類物種。使用關鍵物種的目的是在更接近實際情況的條件下開展風險評估。每種作物種植區域可能有多個關鍵鳥類物種。

4.1 試驗地選擇 選擇的觀測試驗地和作物應與農藥的使用區域和作物一致，并應在農藥的典型使用時期開展試驗。調查的田地至少應相隔250m，以避免重復計算。在報告中應說明試驗地的種植情況及周圍棲息地情況。將數據外推至其他地點或相近作物時，應證明其合理性。

4.2 調查方法 主要有兩種調查方法：樣線法(transect method)和樣點法(point count method)。

4.2.1 樣線法 在種植目標作物的農田確定1縱向基線，觀察者沿基線步行，記錄基線兩側一定距離(如兩側各50m)范圍內的所有鳥類。

4.2.2 樣點法 觀察者在單一位置調查整片農田的鳥類，以避免驚擾鳥類。該方法更適合觀測新耕的農田和裸土上的鳥類。

4.3 數據分析 以下信息與關鍵物種最相關：

4.3.1 農田觀測頻率(frequency of observation in the field,FOfield) 指不考慮觀察到的個體數量如何，只記錄特定物種出現的農田數量占總農田數量的百分比。該方法可用于衡量物種出現的空間頻率，或物種所在的農田比例。一個物種的田間觀測頻率為100%表明在這次觀測中，在所有的農田都觀察到了該物種。

4.3.2 調查觀測頻率(frequency of observation per survey,FOsurvey) 指記錄到特定物種出現的調查頻次占總調查頻次的百分比。該方法可近似的給出整個試驗期間物種出現的時間均勻度。一個物種的調查觀測頻率為100%表明在每次調查時至少觀測到了該物種。

4.4 選擇關鍵物種 優先選擇觀測頻率>20%的物種作為關鍵物種，但同時還應考慮食性、攝食量、體重等因素以確保能保護潛在暴露量最高的物種。農田觀測頻率或調查觀測頻率最高的物種并不一定就是關鍵物種。例如，燕子在某段時間在農田中普遍存在、數量較多，雖然其單位體重食物攝取量高、攝食小型無脊椎動物，但其主要攝食空中的無脊椎動物，其食物中農藥的殘留量低，不能外推到保護其他物種，不宜作為關鍵物種[2]。Dietzen[9]等歐盟農藥鳥類風險評估中的關鍵物種，并給出了確定小麥田關鍵物種的示例。

5 優化PT和PD

PT為鳥類在施藥區域獲得食物的時間比例，PD為不同食物類型在鳥類飲食中的比例。在初級評估中，假定PT和PD均為1(即假定某種鳥類的食物數量及種類均來自于有農藥暴露的農田食物)，但如果有足夠的信息則可以優化PT和PD。不同的作物和鳥類物種會得出不同的PT和PD，在優化PT和PD時，通常將重點放在一種或兩種關鍵物種上。

5.1 PT 在田間很難直接獲得鳥類在施藥區域攝食比例的數據，因此可以根據在施藥區域中消耗的時間來估算PT?？梢酝ㄟ^無線電跟蹤的方式獲得PT數據，捕捉野生鳥類并安裝無線電發射器或GPS裝置，并記錄其在施藥農田中的活動時間。無線電跟蹤的同時進行人工觀察，則可明確在施藥農田中的覓食時間。

目前尚無國際公認的試驗準則，但歐盟評估指南[2]的附錄P中對該類試驗有較詳細的說明，試驗計劃可參考Crocker等[10]研究報告的附錄1，將無線電發射器安裝到小型鳥類尾羽上的方法可參考該報告的附錄2。

5.1.1 無線電跟蹤方法 使用無線電跟蹤技術的目的一是定位鳥類個體，以便觀察其行為；二是在一段時間內持續跟蹤某一鳥類個體，以明確其在施藥農田中活動的時間比例。

在每次觀測過程中，應持續跟蹤鳥類個體。鳥類行為和位置的變化記錄應精確至分鐘，應定時更換觀測人員以保持觀測人員注意力集中。試驗中應觀測鳥類在全天(從日出至日落)的活動，而不管鳥類的依從性如何，即不因鳥類離開而縮短觀測時間、也不因鳥類易于觀測而延長觀測時間。

使用八木天線可以確定被跟蹤鳥類的位置，無線電信號強度可估算與鳥類的距離。為盡量準確描述被跟蹤鳥類的行為并驗證其位置，當鳥類未被植被隱藏時，盡量目視或使用望遠鏡觀察鳥類?？墒褂糜蓄伾哪_環幫助識別鳥類個體。保持適當的安全距離以避免影響鳥類的行為。

鳥類的覓食行為與鳥類生殖周期不同階段的營養需求、棲息地環境和食物供應等因素有關，PT也會因這些因素的改變而變化。因此應在登記作物的典型生長階段以及具有代表性的棲息環境開展試驗。通常至少應在給定場景中捕捉20只關鍵鳥類并觀測其活動。

5.1.2 鳥類個體PT的計算 根據無線電跟蹤試驗觀測結果，可將觀測鳥類的行為分為“可能在覓食”與“不在覓食”兩種情況(表1)。

表1 用于計算PT的鳥類行為類別

觀測鳥類個體的PT=在目標作物的覓食時間/總覓食時間。鳥類個體PT的計算示例(表2)，假設無線電跟蹤觀測結果表明觀測鳥類在目標作物的覓食時間為4h，則PT=4h/9h=0.44。

表2 鳥類個體PT計算的示例

5.1.3 風險評估所需PT的計算 通常無線電跟蹤試驗會跟蹤觀測20只鳥，因此可結算出20個觀測鳥類個體的PT。歐盟評估指南[2]中并未規定在風險評估中應如何使用，只指出“如果用中位值或平均值代替默認的PT=1，則在沒有其他安全系數的情況下，將表明風險評估僅對一半目標種群具有保護作用。風險管理人員需確定應保護的種群比例?！?。目前歐盟成員國在評估中使用個體PT的第90百分位[11]，計算方法如下：

第一步：檢查數據

①所跟蹤的物種是關鍵物種；

②作物與GAP相關；

③季節與GAP相關；

④環境是農藥將使用的典型區域；

⑤跟蹤足夠數量的鳥類(至少20只)。

第二步：檢查所有觀測鳥類是否都是覓食鳥，即個體PT>0，對于數據為0的觀測鳥類個體，則排除該鳥的數據。對于跟蹤多于1d的觀測鳥類個體，使用每日PT的平均值作為該個體的PT。

第三步：計算覓食鳥個體PT數據的第90百分位，即可得出風險評估中使用的PT。

從風險評估的原理上來說，在長期風險評估中使用21d時間加權平均PT是合理的，但目前尚無在農藥風險評估中使用多個體、多天的跟蹤數據的導則。Ludwigs等[12]提出了利用蒙特·卡羅方法計算21d平均PT的方法。

5.2 PD 在優化PD時，可以通過分析鳥類胃內容物、糞便和食丸來確定鳥類的食物來源。

5.2.1 捕鳥及樣品采集 可使用網或陷阱捕捉觀測鳥類。試驗應在合適的季節進行，網或陷阱應放置在目標作物或至少靠近目標作物。試驗地點應代表農藥的使用地點。捕捉觀測鳥類后，可通過獲取糞便或胃內容物樣品來獲取鳥類的飲食樣品。通常，糞便樣品會提供更可靠的結果。

(1)糞便采樣

可將觀測鳥類放在干凈的袋子或聚乙烯片上收集糞便。也可以在田間(例如鳥類停留地、棲息地、筑巢地)收集糞便。糞便樣品應單獨存放，可用氯化鈉保存。

(2)胃內容物取樣

將涂有凡士林的細塑料管插入胃中，通過注射器將溫水泵入胃中，直到食道和胃的內容物排空。將獲得的樣品轉移到樣品容器中并用酒精保存。

5.2.2 收集參照物 在試驗區域采集鳥類食物(如無脊椎動物、種子或植物)，可幫助估計鳥類食物的原始尺寸。

5.2.3 樣品檢測 用顯微鏡研究鳥類的食物樣品。昆蟲遺骸至少區分至科，其他無脊椎動物至少區分至綱。通過分析角質層的結構，特別是氣孔可以確定食物樣品中的植物種類。通過分析外殼殘留物來識別種子。

無脊椎動物或植物的特征部分(例如節肢動物的幾丁質碎片、蚯蚓的剛毛、種子碎片(果皮)、植物(即葉子和莖的面積))的大小可以用測微目鏡測定。

為量化不同類型食物的數量(例如節肢動物的數量)，應對每個樣品中發現的食物碎片計數，并計算出占指定殘骸數量所需的最小個體數據。例如甲蟲的兩個右下頜骨和一個左下頜骨可歸因于至少兩個個體。果實和種子的數量可通過測量碎片的面積并將其除以參照果實或種子的面積來獲得。

試驗結果的質量在很大程度上取決于操作人員識別遺骸的能力。提前捕捉觀測鳥類并喂食不同食物有助于量化食物樣品回收率。

5.2.4 數據評估

(1)將樣品中的食物數量轉化為鳥類實際攝入的食物數量

使用校正因子將糞便或胃內容物樣品中食物數量轉化為鳥類實際攝入的食物數量。消化過程中在某些食物幾乎完整的情況下，另一些食物可能已完全消失，因此每種類型的食物需使用特定的校正因子。蚯蚓或其他土壤無脊椎動物通常被迅速消化，而許多節肢動物的角質層部分通常不易消化而容易在糞便中識別出來。某些食物類型和鳥類的校正因子可從文獻中得出[13，14]。也可以捕捉鳥類在圈養條件下進行飼喂試驗，以確定校正因子。

(2)根據攝入食物的長度計算食物的干重

可使用相關文獻[15，16]中的回歸方程將估算的食物長度轉換為食物干重。

5.2.5 注意事項 有關食物組成的數據應與申請的用途有關，即與棲息地和施藥時間都有相關性。應注意，該數據可能會低估蚜蟲等易消化食物的比例。

然后使用上述數據重新計算風險商值。對于攝入多種食物的情況，應計算每種食物類型的預測暴露劑量，并將其相加以獲得總預測暴露劑量。

優化PD時，應注意以下幾點：

——優化PD并不總是導致RQ減??；

——PD值總和應為1；

——飲食構成的假設應充分合理；

——數據應先換算為干重，然后再用于估算PD。

——如果施藥區域和未施藥區域的飲食組成不同，應基于施藥區域的飲食數據估算PD。

6 確定長期毒性試驗終點的相關性

環境風險評估的目標是預測對種群水平的影響，一般認為如果不影響個體的存活率、繁殖率和發育，則不會對種群產生影響。因此，毒性試驗中只有與這些關鍵因素有關的終點才具有生態毒理學意義。無可觀察作用水平(NOEL[1])基于試驗的最敏感端點，在高級評估中可以考慮高于NOEL的劑量所見效應的生態相關性。

6.1 終點類別 鳥類繁殖毒性試驗包括成鳥和繁殖的終點。如果NOEL基于繁殖的終點，但暴露時間是在繁殖季節以外短暫發生的，則基于成鳥影響的NOEL更相關。

6.2 繁殖終點 通常應選擇與總體繁殖率相關的終點來定義鳥類的長期NOEL。根據具體情況和數據情況，可能是繁殖率、幼鳥的生存率或生長率、成鳥或幼鳥的行為參數。

6.3 毒性效應的大小 NOEL是基于統計顯著性而非生物學顯著性。在高質量的鳥類繁殖試驗中，有可能表明5%的孵化重量的偏差具有統計顯著性，而在普通試驗中不具有統計顯著性。如果第14d幼鳥體重正常，則不將這種效應視為生物學相關。應避免根據經驗判定與對照相比的20%或其他任何差異為相關。相反，在質量較差的試驗中，統計學上無顯著性差異并不一定意味著沒有生物學上的顯著影響。

6.4 效果隨時間的變化 暴露終止后短時或可逆的亞致死作用不如連續或不可逆作用重要。

7 研究鳥類的去殼行為

對于吃種子的鳥類，去殼行為可降低農藥暴露?？捎^察到去殼行為的主要是小型鳥類，但并非所有小型鳥類都有去殼行為，某些物種對部分特定種子類型存在去殼行為。在野外，去殼行為可能取決于攝食壓力、捕食或競爭等脅迫。對于體重超過50g的鳥類，應假定沒有去殼行為。

關于鳥類的去殼行為對農藥暴露的定量研究很少，現有數據表明鳥類攝食去殼種子的數量及去殼行為對農藥暴露量的減少都與種子結構密切相關。由于缺乏可靠數據，必須有證據表明關鍵物種在田間條件下存在去殼行為。此外，如果一個或幾個種子或顆粒劑中含有的農藥有效成分已達到該農藥對鳥類的半致死劑量時，也不考慮鳥類的去殼行為。

為明確去殼行為對農藥暴露的影響，應對相關的鳥類關鍵物種、種子類型和農藥開展試驗，避免外推增加不確定性。如果風險評估中考慮了鳥類的去殼行為，則同時應評估沒有去殼行為的鳥類物種的風險。如果評估結果表明沒有去殼行為的鳥類物種的風險不可接受，則風險仍不可接受。