獨腳金內酯對蜜環菌生長的影響*

許存賓，張建昆，孟 攀，田 野，蔡 菊，朱國飛

（貴州理工學院，貴州 貴陽 550003）

獨腳金內酯（strigolactones，SLs） 是來源于植物類胡蘿卜素代謝途徑的一類萜類小分子化合物，是近年發現的能調控植物生長發育的新型植物激素[1]，并且還能分泌到根外影響根系周圍土壤微生物的生長[2-3]。獨腳金內酯最初是在研究寄生雜草獨腳金（Striga spp.）的種子萌發信號物質時，在寄主棉花的根際分泌物中被發現的[4]。目前已在植物中鑒定出約36種天然獨腳金內酯化合物，并人工合成了多個類似物[5]。獨腳金內酯在植物中的合成途徑和功能已被廣泛研究，其能影響植物分枝、分蘗、葉片發育、株高、花青素合成、根系生長以及抗逆性等[6-8]。獨腳金內酯對微生物生長的影響在叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）中研究較多，其能促進叢枝菌根真菌的孢子萌發、菌絲分枝、線粒體代謝及與植物共生關系的形成[9]，從而促進叢枝菌根和植物的生長，但是獨腳金內酯具體如何影響叢枝菌根分枝的分子調控機制仍不清楚。獨腳金內酯還對部分植物病原真菌[10-11]、內生菌[12]產生影響，但表現形式并不統一，可能促進菌絲生長和分枝，也可能抑制菌絲生長和分枝[10]。

蜜環菌（Armillaria mellea） 是傳統的食藥兼用真菌，與名貴藥用植物天麻為共生關系，能為天麻生長提供營養物質[13]，同時其本身也具有與天麻相似的藥理作用。Yuan等[14]發現獨腳金內酯能促進蜜環菌形成分枝，黃靖雯等[15]發現獨腳金內酯能促進高盧蜜環菌（Armillaria gallica） 形成分枝，且認為幾丁質酶可能參與了蜜環菌分枝的形成。但目前關于獨腳金內酯對蜜環菌生長的影響報道仍較少。蜜環菌的分枝及生長情況能影響藥用植物天麻的生長和產量，通過分析獨腳金內酯GR24對蜜環菌的分枝數、菌絲干質量及多糖產量的影響，為獨腳金內酯在蜜環菌或天麻生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

蜜環菌菌株A9，為蜜環菌液體深層發酵和天麻人工栽培生產中的常用菌種，購于華中農業大學應用真菌研究所。

1.1.2 化學試劑

將獨腳金內酯GR24（上海源葉生物科技有限公司）用丙酮溶解，配制成質量濃度為0.1 mg·mL-1的儲備液。將儲備液進行稀釋，制備質量濃度為0.01 mg·mL-1的工作液。

丙酮、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、KH2PO4、MgSO4、NaCl均為分析純 （AR）。

1.1.3 培養基及配方

市售玉米粉、菜籽餅，瓊脂粉、酵母浸粉均為生物試劑（BR）。共使用3種培養基，配方見表1。

如表1所示，PDA培養基為蜜環菌培養基礎培養基；玉米粉-菜籽餅液體培養參照陳偉[16]的研究結果；玉米粉-酵母浸粉液體培養基將玉米粉-菜籽餅培養基中的菜籽餅替換為酵母浸粉，以改進菜籽餅顆粒不易從菌絲體上分離的問題。

表1 培養基配方Tab.1 Medium formulation

1.2 蜜環菌培養

1.2.1 固體培養基培養

無菌條件下，分別向滅菌冷卻后尚未凝固的PDA培養基中分別添加GR24工作液，使其最終質量濃度為 0、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、1.5 μg·L-1、2.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1，以及單獨添加 30 μL 丙酮（CK），各處理混勻后倒板。分別接種經PDA培養基活化的蜜環菌（取長度為5 mm的菌索） 于培養皿中央，置于25℃條件下恒溫培養，定期觀察并記錄，每個處理3次重復。

1.2.2 液體培養基培養

無菌條件下，分別向滅菌冷卻后的液體培養基中添加GR24工作液，使其最終質量濃度為0、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、1.5 μg·L-1、2.0 μg·L-1、2.5 μg·L-1。接種經PDA培養基活化的蜜環菌（取長度為5 mm的菌索），置于25℃、121 r·min-1條件下振蕩培養，定期觀察并記錄，每個處理3次重復。

1.3 蜜環菌菌索計數與分枝率計算

分別在培養11 d、14 d、17 d、20 d對培養皿內肉眼可觀察到的菌索進行統計，得到菌索總數；再對菌索上出現分枝的菌索進行計數，得出分枝菌索數。蜜環菌菌索分枝率（R，%）的計算公式為：

式中：Nb為分枝菌索數（個）；Nt為菌索總數（個）。

1.4 蜜環菌菌絲干質量的測定

測定固體培養的蜜環菌菌絲干質量：將固體培養基融化后用蒸餾水洗滌菌絲，獲得無培養基殘留的菌絲置于培養皿中，75℃烘箱烘干至恒重。

測定液體培養的蜜環菌菌絲干質量：將液體培養的蜜環菌通過20目標準檢驗篩，用100 mL蒸餾水洗滌菌絲球；將濾液再次通過100目標準檢驗篩，用50 mL蒸餾水洗滌菌絲球。將2次過濾所得菌絲球置于培養皿中，75℃烘箱烘干至恒重。

1.5 蜜環菌多糖的測定

蜜環菌多糖的測定方法參考張琦等[17]的苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準物質測定標準曲線，以上述培養獲得的干菌絲為樣品進行多糖含量的測定。

1.6 數據分析

試驗數據使用Microsoft office 2019軟件整理，GraphPad Prism軟件進行分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 GR24對蜜環菌生長和分枝的影響

通過在PDA培養基中添加不同濃度獨腳金內酯GR24后培養蜜環菌，培養11 d、14 d、17 d和20 d時觀察其生長情況，結果見圖1。

圖1 不同GR24質量濃度對蜜環菌生長和分枝的影響Fig.1 Effect of different mass concentrations of GR24 on Armillaria mellea growing and branching

如圖1A所示，GR24能顯著增加蜜環菌分枝，菌索兩側產生大量毛刺狀凸起。

如圖1B和1C所示，菌索總數與分枝菌索數的變化情況基本一致。添加GR24質量濃度為1 μg·L-1時，菌索總數和分枝菌索數最少，且均低于對照組（CK）；而后隨GR24添加量的增加，促進了蜜環菌的生長，且當質量濃度為2 μg·L-1時，培養11 d的蜜環菌菌索和分枝菌索的數量均已顯著超過對照組（CK）；GR24 在低質量濃度時抑制生長、2 μg·L-1時促進生長的結果，與Dor Evgenia[10]研究獨腳金內酯對根部病原菌生長影響的結果相一致。當GR24質量濃度為2.5 μg·L-1時，培養前期蜜環菌生長速度較慢，培養20 d后其菌索總數和分枝菌索數達到最大值；這可能是因為GR24在培養基內發生了消耗或降解，時間延長后降低至蜜環菌生長的最適濃度。另外，使用丙酮處理的對照組（CK）中菌索總數略少于GR24質量濃度為0的試驗組，但兩者之間無顯著差異性。

如圖1D所示，添加GR24后分枝率顯著增加。其中，當質量濃度為2.0 μg·L-1時，統計不同培養時長的蜜環菌分枝率均為最高。但不同質量濃度的獨腳金內酯對真菌生長和分枝的影響仍存在很大區別[18]，因為獨腳金內酯是脂溶性分子，在不同溶劑和培養基介質的溶解、擴散等存在差異，這也導致同一處理中菌索生長數據離散性加大。

綜合分析顯示，GR24在低質量濃度（＜2.0 μg·L-1）以及高質量濃度（＞2.0 μg·L-1）下均會抑制蜜環菌菌索生長，但能促進其菌索分枝的形成。這與前期報道的獨腳金內酯對AM真菌、植物病原真菌的結果相一致[9-11]；當獨腳金內酯GR24的質量濃度為2.0 μg·L-1時，既可促進菌索生長，又可提高蜜環菌的分枝菌索數和分枝率。

2.2 GR24對蜜環菌菌絲球形態的影響

使用添加GR24的玉米粉-菜籽餅液體培養基培養的蜜環菌菌絲體見圖2。

如圖2所示，使用液體培養基培養的蜜環菌菌絲體呈球形，添加不同質量濃度的獨腳金內酯GR24對菌絲球的大小有顯著的影響。添加獨腳金內酯GR24后形成的菌絲球直徑均大于不添加的處理；其中GR24質量濃度為1.0 μg·L-1的培養液中形成的菌絲球直徑最大，但數目最少。此外，使用添加不同質量濃度GR24的玉米粉-酵母浸粉液體培養基培養蜜環菌，其菌絲球生長情況與前者相似。因此，推測獨腳金內酯能增加蜜環菌液體培養菌絲球的大小，可能是其可促進蜜環菌分枝，分枝纏繞易形成大的菌絲球。

圖2 不同GR24質量濃度的玉米粉-菜籽餅液體培養基中的蜜環菌菌絲球Fig.2 Mycelium pellets of Armillaria mellea in liquid media of cornmeal-yeast extract powder with different mass concentrations of GR24

2.3 GR24對蜜環菌菌絲干質量的影響

對PDA固體培養基中培養20 d的蜜環菌和玉米粉-酵母浸粉液體培養基中培養18 d的蜜環菌菌絲干質量進行測定，結果見圖3。

圖3 不同GR24質量濃度對蜜環菌菌絲干質量的影響Fig.3 Effect of GR24 on dry weight of Armillaria mellea mycelia at different mass concentrations

如圖3所示，隨著GR24質量濃度的升高，固體和液體培養基中蜜環菌的菌絲干質量均呈現先下降后上升的趨勢；在GR24質量濃度為2 μg·L-1時菌絲干質量達到最大，而后又降低。這與GR24對菌索數量的影響結果一致，低質量濃度對蜜環菌的生長有抑制作用，當質量濃度為2 μg·L-1時則促進其菌生長。

2.4 GR24對蜜環菌多糖含量的影響

試驗采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖作為標準物質，得到的葡萄糖標準液線性回歸方程為：

該回歸方程的相關系數R2為0.999 1。

取玉米粉-菜籽餅液體培養基與玉米粉-酵母浸粉液體培養基培養20 d的蜜環菌菌絲，烘干后測定其多糖含量，因獲得的菌絲較少，取3個重復混合后進行測定，結果見圖4。

圖4 不同GR24質量濃度對蜜環菌菌絲多糖含量的影響Fig.4 Effect of GR24 on the polysaccharide content of Armillaria mellea mycelia at different mass concentrations

如圖4所示，隨著GR24質量濃度的升高，2種液體培養基中蜜環菌菌絲的多糖含量逐漸增加，在GR24質量濃度為2.0 μg·L-1時多糖含量達到最大值，隨后開始下降。玉米粉-酵母浸粉培養基中菌絲多糖的含量略高于玉米粉-菜籽餅培養基中菌絲多糖的含量，這為后期開展蜜環菌液體培養的培養基選擇提供一定參考。蜜環菌多糖是其藥用成分之一，具有一定抗腫瘤、抗驚厥和降血脂等藥理活性[19-20]，添加獨腳金內酯能增加蜜環菌多糖含量，對蜜環菌液體發酵和開發應用具有一定的指導意義，但獨腳金內酯促菌絲多糖含量增加的機制有待進一步研究。

3 討論與結論

獨腳金內酯作為一種新型植物激素，既能調控植物生長發育，還能影響相關微生物的生長。蜜環菌是藥用植物天麻的共生菌，為其生長提供營養物質和能量，因此探究了不同質量濃度的獨腳金內酯GR24對蜜環菌生長的影響。研究發現，獨腳金內酯能顯著影響蜜環菌菌絲分枝，這與Yuan等[14]的發現一致，低質量濃度的獨腳金內酯（1.0 μg·L-1）能快速促進蜜環菌分枝，高質量濃度（2.0 μg·L-1）在長期促進蜜環菌分枝方面更顯著，但質量濃度過高可能會抑制蜜環菌分枝。獨腳金內酯可提高蜜環菌菌絲干質量，質量濃度為2.0 μg·L-1時菌絲干質量增加最為顯著。獨腳金內酯能促菌絲體形成的菌絲球直徑增大，這可能與其促進蜜環菌分枝從而菌絲更易相互纏繞有關。此外，還發現獨腳金內酯能促進蜜環菌多糖的形成，當質量濃度為2.0 μg·L-1時促進作用最佳。

獨腳金內酯能顯著影響蜜環菌的生長發育，為調控蜜環菌和天麻的生產提供新的思路；且蜜環菌培養方便，為研究獨腳金內酯與真菌之間的作用機制提供新的研究材料。早期對獨腳金內酯影響土壤微生物的研究集中在叢枝菌根真菌，認為獨腳金內酯會通過激活線粒體[21]、激發ROS相關基因表達[11]等分子機制促進真菌分枝，但由于叢枝菌根真菌難培養、多核且無法建立遺傳轉化體系而難于開展深入研究；也有部分研究者將研究對象轉向植物病原真菌[11]；而蜜環菌-天麻的共生模式與叢枝菌根真菌-植物的共生模式更為相似，更有利于開展獨腳金內酯調控真菌生長的分子機制研究。此外，目前關于蜜環菌-天麻之間的共生機制仍有很多問題尚未解決，獨腳金內酯可能是影響兩者共生關系的調節因素，為開展共生機制研究提供新的方向。通過闡述獨腳金內酯對蜜環菌生長的影響，為利用獨腳金內酯提高蜜環菌和天麻的產量提供理論基礎，但其作用機制和應用方式仍有待進一步研究。