醛固酮通過ROS/NLRP3/Smad通路促進肝纖維化研究

黃珊,王國振,蔡雙明,張文雍,金思一,寧佐偉

肝纖維化是嚴重威脅人類生命健康的疾病。每年有數百萬病人由自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝病等疾病發展為肝纖維化，肝纖維化進一步發展，可進展為肝硬化、肝癌[1-3]。目前肝纖維化的發病機制不明，并且缺乏特異性治療方法。因此，進一步研究并明確肝纖維化的發生機制，尋找有效治療方法，有著重要的臨床意義。

醛固酮是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)重要成分，既往被認為是經典的血壓以及容量調節激素，在調節水電解質平衡方面有著重要作用。近年來發現其參與了器官纖維化的發生發展過程[4-6]。NLRP3炎癥小體由Nod-like receptor3(NLRP3)，apoptosis-associated speck-like protein(ASC)以及caspase-1(Casp1)組成，當炎癥、缺氧等因素刺激NLRP3活化后，可與ASC、Casp1前體pro-Casp1結合，剪切Casp1前體pro-Casp1形成有活性的Casp1。 NLRP3、ASC、Casp1進一步組成活化的NLRP3炎癥小體復合物，剪切IL-1β的前體pro-IL-1β，生成IL-1β[7-9]。本課題組既往的研究中證實醛固酮可以促進NLRP3炎癥小體活化，IL-1β生成導致肝纖維化發生[10]。但醛固酮是如何引起NLRP3炎癥小體活化，以及IL-1β如何促進肝纖維化發生等機制仍未完全闡明[11-13]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)活化堆積導致氧化應激(oxidative stress，OS)，這一過程與肝纖維化[14-16]以及NLRP3炎癥小體[17-19]活化密切相關。Smad通路是肝纖維化中經典通路，Smad2、3活化后與Smad4結合，促進肝纖維化發生[20]。為進一步明確醛固酮引起NLRP3炎癥小體通路活化及明確其下游通路，本課題使用了敲除NLRP3基因的小鼠建立四氯化碳(CCl4)模型，并且通過分離野生型及NLRP3基因敲除小鼠肝原代星狀細胞，擬證明：醛固酮通過ROS活化NLRP3炎癥小體，引起IL-1β生成，并通過Smad2、3通路活化促進肝纖維化發生這一結論。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

醛固酮(aldosterone)、依普利酮(醛固酮拮抗劑，eplerenone)、螺內酯(醛固酮拮抗劑，spironolactone)、DPI(ROS拮抗劑，diphenyleneiodonium)、NAC(ROS拮抗劑，N-acetylcysteine)、IL-1β抑制劑、四氯化碳由Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)公司提供，IL-1β由ProSpec(Protein Specialists, Rehovot, Israel)公司提供。

1.2 動物模型

南方醫科大學動物實驗倫理委員會批準了小鼠實驗方案。南方醫科大學動物中心提供野生型雄性C57小鼠(6～8周齡，18～22 g)，Jackson實驗室(B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/J)提供NLRP3敲除小鼠(雄性，6～8周齡，18～22 g)。動物在南方醫科大學動物實驗中心飼養。18只野生型小鼠隨機分為兩組：野生型對照組、野生型模型組。野生型對照組小鼠每隔5 d皮下注射5 mL/kg橄欖油1次，連續3個月；野生型四氯化碳模型組小鼠每隔5 d注射5 mL/kg 20%四氯化碳1次，連續3個月。同樣，將18只NLRP3基因敲除小鼠隨機分為NLRP3基因敲對照組和NLRP3基因敲除四氯化碳模型組，NLRP3基因敲除對照組小鼠每隔5 d皮下注射5 mL/kg橄欖油1次，連續3個月；NLRP3基因敲除四氯化碳模型組小鼠每隔5 d注射5 mL/kg 20%四氯化碳1次，連續3個月。3個月后分離肝星狀細胞，并留取肝組織石蠟、冰凍標本。

1.3 原代肝星狀細胞分離與細胞培養

依據既往發表的文章中方法分離野生型及NLRP3基因敲除對照組C57小鼠原代肝星狀細胞[21]。使用含20%胎牛血清的DMEM培養基進行培養。細胞生長至75%后，在無血清培養基中培養1 d，分別使用螺內酯(10-5M)、依普利酮(10-5M)、DPI(5 μM)、NAC(10-3M)、IL-1β (2 ng/mL)或IL-1β 抑制劑(10 ng/mL)刺激60 min后，加入醛固酮(10-7M)刺激24 h。

1.4 指標檢測方法

1.4.1 免疫組織化學

肝組織經福爾馬林溶液固定后，分別使用75%、80%、85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇脫水30 min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡15 min。然后，將組織進行石蠟包埋，并切成4 μm石蠟切片。在60 ℃烘箱中烤片2 h。

切片按以下順序進行二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min，100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%、75%乙醇和去離子水各5 min。

使用檸檬酸鹽進行抗原修復。封閉液進行封閉后，使用一抗(1∶100)4 ℃孵育切片過夜。洗片后使用二抗室溫孵育1 h，洗片后進行DAB染色，封片。

1.4.2 過氧化氫含量測量

5～10 mg肝組織與100 μL裂解液(S0051，Beyotime，中國)混合，12 000 g離心5 min，收集上清。用裂解液稀釋標準樣品。然后，50 μL上清液或標準樣品與100 μL過氧化氫檢測試劑混合。在環境溫度下放置30 min后，使用酶標儀560 nm波長檢測樣品。肝原代細胞過氧化氫檢測同上。

1.4.3 蛋白質印跡分析

用裂解液(89900，Thermo Fisher Scientific)將肝組織研磨均勻，并在4 ℃離心以收集上清。使用Pierce BCA蛋白質分析試劑盒(23225，Thermo Fisher Scientific)測定蛋白質濃度，并將上清液與5倍上樣緩沖液混合，煮沸變性。電泳后，蛋白質轉移到硝化纖維素膜上。封閉液封閉1 h，使用Ⅰ型膠原、Smad2/3、NLRP3、IL-1β, ASC、caspase-1和α-SMA的一抗(1∶1000；Cell Signaling Technology)或β-actin一抗(1∶700；Santa Cruz Biotechnology)4 ℃孵育過夜。二抗(1∶7 500)室溫孵育1 h后，用熒光分析儀定量熒光強度。

1.5 統計分析

2 結果

2.1 CCl4模型組小鼠肝組織中H2O2含量增加

與野生型對照組相比，野生型 CCl4模型組中小鼠肝臟組織中H2O2含量明顯增加(圖 1A)，兩組間差異具有統計學意義(圖1A)。提示ROS可能參與肝纖維化過程。

2.2 NLRP3炎癥小體活化后促進IL-1β及 Smad2/3表達

免疫組化提示，與野生型對照組相比野生型CCl4模型組小鼠肝組織中IL-1β以及Smad2/3蛋白表達明顯增高(圖1B)。NLRP3基因敲除CCl4模型組與野生型CCl4模型組相比，IL-1β以及Smad2/3的蛋白表達降低(圖1B)。上述蛋白含量改變差異具有統計學意義。提示NLRP3通過IL-1β以及Smad2/3作用于肝星狀細胞，促進肝纖維化發生。

圖1 野生型CCl4模型小鼠中ROS、IL-1β、Smad2/3含量升高，抑制NLRP3炎癥小體后IL-1β、Smad2/3含量降低 A:野生型CCl4模型組中肝組織ROS含量; B:野生型及NLRP3敲除小鼠對照組及CCl4模型組肝組織中IL-1β、Smad2/3含量改變。*與野生型對照組相比，P<0.05，#與野生型CCl4模型組相比，P<0.05

2.3 醛固酮促進原代肝星狀細胞活化以及Ⅰ型膠原生成

為了進一步研究醛固酮對肝纖維化的影響，我們用醛固酮及其抑制劑(螺內酯以及依普利酮)刺激由野生型小鼠肝臟分離的原代肝星狀細胞,使用螺內酯及依普利酮刺激1 h后加入醛固酮培養24 h。與對照組相比，醛固酮刺激組中α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白含量增加，抑制醛固酮后可以抑制上述蛋白含量增加(圖2A)，差異具有統計學意義。提示醛固酮可以促進星狀細胞活化，肝纖維化發生。

2.4 醛固酮通過ROS調節NLRP3炎癥小體活化，α-SMA以及Ⅰ型膠原合成

用醛固酮抑制劑(螺內酯以及依普利酮)刺激由野生型小鼠肝臟分離的原代肝星狀細胞1 h后，加入醛固酮。與對照組相比，醛固酮刺激組中的H2O2含量上調。抑制醛固酮后可以抑制H2O2含量上調(圖2B)。差異具有統計學意義。提示醛固酮促進ROS生成。

在野生型肝原代星狀細胞中，使用NAC以及DPI抑制ROS合成后，加入醛固酮。NAC、DPI可以抑制醛固酮引起的ASC、caspase-1、IL-1β、Ⅰ型膠原、α-SMA蛋白含量增加(圖2C)，差異具有統計學意義。提示醛固酮通過ROS引起NLRP3炎癥小體激活，星狀細胞活化，肝纖維化發生。

圖2 醛固酮通過ROS調節NLRP3炎癥小體/IL-1β活化，α-SMA以及Ⅰ型膠原合成 A:醛固酮及其抑制劑刺激野生型肝原代星狀細胞后，α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白含量改變; B:醛固酮及其抑制劑刺激野生型肝原代星狀細胞后H2O2含量改變; C:醛固酮及ROS抑制劑刺激野生型肝原代星狀細胞后， ASC、caspase-1、IL-1β、Ⅰ型膠原、α-SMA蛋白含量改變。*與對照組相比，P<0.05。&與醛固酮刺激組相比，P<0.05

2.5 IL-1β通過Smad2/3信號通路促進α-SMA、Ⅰ型膠原表達

通過醛固酮刺激野生型原代肝星狀細胞后，使用IL-1β阻斷劑抑制IL-1β表達。與醛固酮刺激組相比，抑制IL-1β表達后，使NLRP3炎癥小體組分、Ⅰ型膠原、磷酸化Smad2/3以及α-SMA蛋白表達下調(圖3A)，差異具有統計學意義。提示醛固酮通過IL-1β刺激Smad2、3活化，星狀細胞活化、肝纖維化發生。

使用IL-1β分別刺激野生型以及NLRP3敲除小鼠分離的肝原代星狀細胞。與野生型對照組相比，野生型IL-1β刺激組中NLRP3、ASC、Caspase1、α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白含量上調(圖3B)。與野生型IL-1β刺激組相比，NLRP3敲除IL-1β刺激組中上述蛋白表達降低(圖3B)。差異具有統計學意義。提示IL-1β刺激Smad2、3活化，星狀細胞活化、肝纖維化發生。IL-1β可能會反作用于NLRP3炎癥小體活化，促進肝纖維化發生。

圖3 IL-1β通過Smad2/3信號通路促進α-SMA、Ⅰ型膠原表達 A:醛固酮及IL-1β抑制劑刺激野生型肝原代星狀細胞后，相關蛋白含量改變; B:IL-1β刺激野生型以及NLRP3敲除肝原代星狀細胞后相關蛋白含量改變。*與野生型對照組相比，P<0.05。#與野生型醛固酮刺激組相比，P<0.05

3 討論

本文利用NLRP3敲除小鼠構建CCl4肝纖維化模型，通過分離野生型及NLRP3基因敲除小鼠肝原代星狀細胞證明：醛固酮通過ROS導致NLRP3炎癥小體活化，通過IL-1β/Smad2、3通路促進肝纖維化發生。

非病毒性肝纖維化多是由脂肪肝、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等多種疾病發展而形成。肝纖維化最終可發展成為肝硬化、肝癌[22-23]，嚴重威脅人類生命健康。我國是肝病大國，肝纖維化發病率較高。肝纖維化病情隱匿，多無明顯臨床癥狀，多發展為失代償期肝硬化等疾病后可出現臨床癥狀。但目前肝纖維化的確切發病機制不明，缺乏有效的特異治療方法，因此進一步研究闡明肝纖維化的發病機制，進一步尋找潛在治療靶點，尋找有效治療方法有著非常重要的臨床意義[24]。

醛固酮是經典的水鈉調節激素，既往認為醛固酮有著保水、保鈉、排鉀等作用，醛固酮抑制劑多在高血壓等疾病中應用。但近年來證據證明，醛固酮與器官纖維化密切相關。醛固酮可以通過NLRP3炎癥小體活化導致器官損傷。Bai等[25]證明醛固酮引起的NLRP3炎癥小體活化，活化的NLRP3炎癥小體可以進一步導致腎臟損傷;Xiao B等[26]證實MnTBAP治療可以通過調節NLRP3炎癥小體活化，從而減輕醛固酮引起的腎臟損傷;Bruder-Nascimento等[27]證明醛固酮引起的NLRP3炎癥小體活化在血管損傷方面有著重要的作用。在既往實驗中，本課題組證明醛固酮可以通過NLRP3炎癥小體活化促進肝纖維化發生[10]。然而，醛固酮如何引起NLRP3炎癥小體活化的呢，目前仍為具體闡明。

氧化應激是由于活性氧(ROS)以及抗氧化物(antioxidant)失衡，導致活性氧堆積，從而造成組織器官損害。機體生成活化ROS后，其可以通過多種機制引起器官損傷，如炎癥小體通路活化機制、自噬機制、內質網損傷機制等等[28-29]。那么，醛固酮導致的NLRP3炎癥小體活化是否是由ROS引起的呢？在本文體內實驗中，與野生型對照組相比，野生型CCl4刺激組中，ROS含量明顯增加。初步提示ROS與肝纖維化相關。在體外實驗中，醛固酮刺激野生型肝原代星狀細胞后，與野生型對照組肝星狀細胞相比ROS含量增加。抑制醛固酮可以抑制ROS生成。這些結果提示醛固酮促進ROS生成。醛固酮刺激野生型肝原代星狀細胞后，抑制ROS可以抑制NLRP3炎癥小體活化，抑制IL-1β生成，抑制肝纖維化發生，提示醛固酮通過ROS促進NLRP3炎癥小體活化，促進肝纖維化發生。

NLRP3炎癥小體活化可以導致pro-IL-1β生成增多，并剪切pro-IL-1β形成IL-1β，促進肝纖維化發生。但是IL-1β如何促進肝纖維化發生，目前相關機制仍未完全闡明。Smad通路是TGF-β信號通路經典的下游通路，Smad通路蛋白可以分為2類，刺激性Smad(R-Smad)以及抑制性Smad(I-Smad)。R-Smad包括Smad2、Smad3、Smad4等。在磷酸化后，Smad2，Smad3蛋白與Smad4蛋白結合，形成Smad蛋白復合物，促進肝星狀細胞活化[30]，導致肝纖維化發生。在本文中，我們驗證了IL-1β通過Smad通路促進星狀細胞活化，促進肝纖維化發生。在體內實驗中，我們發現野生型模型組中IL-1β，Smad2/3蛋白表達升高，初步提示IL-1β，Smad2/3與肝纖維化相關。體外實驗中，醛固酮刺激野生型肝臟原代星狀細胞后，阻斷IL-1β可導致Ⅰ型膠原，P-Smad2/3，α-SMA表達降低，提示IL-1β通過Smad2/3通路促進肝纖維化發生。有趣的是，當IL-1β被阻斷后，NLRP3炎癥小體通路蛋白表達也降低了，利用IL-1β刺激肝原代星狀細胞可以導致NLRP3炎癥小體活化，提示IL-1β可能對NLRP3炎癥小體有反作用，可以促進NLRP3炎癥小體活化。IL-1β以及NLRP3炎癥小體的相關作用需要進一步研究。

綜上所述，醛固酮通過ROS導致NLRP3炎癥小體/IL-1β/Smad2、3通路活化，促進肝纖維化發生。